◆作者：魏逸峰成艷波陳金濤譚文俊張 麗 史合群

◆單位：1.廣東省微生物研究所，廣東廣州510070；2.廣東碧德生物科技有限公司，廣東廣州510063；3.廣東省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)試驗(yàn)室，廣東廣州510070；4.廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共試驗(yàn)室，廣東廣州510070；5.廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)試驗(yàn)室，廣東廣州510070；6.廣州市科虎生物技術(shù)研究開發(fā)中心，廣東廣州510663

黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco（屬鯰形目（Siluriformes）、鲿科（Bagridae）、黃顙魚屬（Pelteobagrus Bleeker），體色艷麗、肉質(zhì)鮮嫩，是一種優(yōu)質(zhì)名貴經(jīng)濟(jì)魚類。本研究通過誘變與篩選出高產(chǎn)乳酸的新型枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），該菌株耐高溫、耐胃酸和膽鹽。通過將該菌株加工成微生物制劑，并以不同劑量添加到黃顙魚飼料中，探究高產(chǎn)乳酸芽孢桿菌制劑對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)和免疫的影響，為該菌劑產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展也將具有重要的實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)魚

試驗(yàn)魚購自廣東花都區(qū)花東鎮(zhèn)，為性狀優(yōu)良全雄苗種，試驗(yàn)開始前經(jīng)馴化暫養(yǎng)，挑選規(guī)格一致的健康黃顙魚進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 基礎(chǔ)飼料

廣州番禺靈川飼料有限公司成品黃顙魚配合飼料（1號(hào)料）。

1.1.3 菌劑

高產(chǎn)乳酸芽孢桿菌制劑，濃度≥1.0x109cfu/mL；

1.1.4 主要試劑

南京建成A001-1-1總超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒、南京建成A050-1溶菌酶（LZM）檢測(cè)試劑盒等。

1.2 試驗(yàn)條件

試驗(yàn)在廣東微生物研究所養(yǎng)殖試驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)配備體積為1m3魚缸進(jìn)行養(yǎng)殖。魚缸設(shè)有增氧裝置，進(jìn)排水裝置，24 h連續(xù)充氣。每天投喂2次（08：00和18：00），日投喂量為總重的 3%，每2周進(jìn)行一次稱重，調(diào)整日投喂量。采用少量多次的人工飽食投喂。試驗(yàn)結(jié)束后，禁食1天，進(jìn)行生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定及樣品采集。整個(gè)試驗(yàn)周期水溫的變化范圍為25℃～29℃，水體pH變化范圍為7.0～7.5，溶氧＞ 5.0 mg/L。試驗(yàn)采用人工光照，每天光照時(shí)間為12h 光照、12 小時(shí)黑暗（8：00、20：00）。各組定期換水，吸取池底殘餌、糞便、撈取死魚計(jì)數(shù)。

表1 各試驗(yàn)分組飼料的處理方法

1.3 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組1組（CK），試驗(yàn)組 3 組（B-02、B-10、B-50），處理方法如表1所示。

對(duì)照組、試驗(yàn)組各設(shè)3個(gè)缸，4組共計(jì)12缸。試驗(yàn)所用基礎(chǔ)飼料為黃顙魚配合飼料，成分如表2，試驗(yàn)飼料為噴涂了高產(chǎn)乳酸芽孢桿菌的飼料。高產(chǎn)乳酸芽孢桿菌制劑稀釋至飼料重量的 10%（v/w），現(xiàn)喂現(xiàn)噴，風(fēng)干后投喂，以保證菌數(shù)達(dá)標(biāo)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 血清樣品采集方法

黃顙魚樣品采集：取樣前將實(shí)驗(yàn)魚用MS-222麻醉，濃度為25 mg/L，時(shí)間為 15～20min，若魚體呈正常游動(dòng)狀態(tài)，保持靜止不動(dòng)，有聲響時(shí)僅尾部輕微擺動(dòng)，輕觸頭部時(shí)反應(yīng)遲鈍，用手去抓時(shí)不能及時(shí)逃避，表明麻醉成功。每個(gè)試驗(yàn)池隨機(jī)取20尾魚，稱重后取10尾用1mL無菌注射器從黃顙魚尾靜脈內(nèi)抽血，在4℃以下保存 12h，5000 r/min冷凍離心10 min，取上清液-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 指標(biāo)測(cè)定方法

1.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)乳酸芽孢桿菌對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)性能和飼料效率的影響

由表3可見，結(jié)果顯示：黃顙魚生長(zhǎng)性能方面，投喂添加高產(chǎn)乳酸芽孢桿菌飼料的BS-02、BS-10、BS-50組各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)優(yōu)于對(duì)照組CK。相比對(duì)照組，添加芽孢桿菌1.0%的BS-10組黃顙魚增重率顯著提高12.93%（P＜0.05）、特定生長(zhǎng)率顯著提高8.70%（P＜0.05）、蛋白質(zhì)效率顯著提高 9.30%（P＜0.05）、飼料系數(shù)顯著降低 8.54%（P＜0.05）；添芽孢桿菌5.0%的BS-50組黃顙魚增重率顯著提高12.57%（P＜0.05）、特定生長(zhǎng)率顯著提高8.70%（P＜0.05）、蛋白質(zhì)效率顯著提高 8.03%（P＜0.05）、飼料系數(shù)顯著降低 7.28%（P＜0.05）。

表2 基礎(chǔ)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成分

表3 高產(chǎn)乳酸芽孢桿菌對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)的影響

2.2 高產(chǎn)乳酸芽孢桿菌對(duì)黃顙魚血清非特異性免疫的影響

由表4可見，結(jié)果顯示：相比對(duì)照組，BS-02組溶菌酶活力提高4.29%、BS-10組溶菌酶活力提高12.58%，差異顯著（P＜0.05）、BS-50組溶菌酶活力提高8.59%。

相比對(duì)照組，BS-02組超氧化物歧化酶活力提高21.31%，差異顯著（P＜0.05）、BS-10組超氧化物歧化酶活力提高13.57%、BS-50組的超氧化物歧化酶活力提高12.55%。

表4 黃顙魚血清非特異性免疫酶活力

3 討論

3.1 高產(chǎn)乳酸芽孢桿菌對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)性能的影響

江永明等人（2011）研究表明，飼料中分別添加枯草芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌飼喂奧尼羅非魚，都能顯著提高（P＜0.05）增重率，顯著降低（P＜0.05）餌料系數(shù)，顯著提高（P＜0.05）飼料干物質(zhì)和飼料蛋白質(zhì)的表觀消化率。劉翠玲（2015）的研究表明，飼料添加枯草芽孢桿菌可以顯著（P＜0.05）提高鯉魚幼魚生長(zhǎng)和消化酶活性，并可顯著改善其免疫相關(guān)酶的活性。以上研究與本研究結(jié)果相互驗(yàn)證，投喂高產(chǎn)乳酸芽孢桿菌飼料，對(duì)黃顙魚末重、特定生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)、成活率具有促進(jìn)作用，但不產(chǎn)生顯著影響，當(dāng)添加量達(dá)到1.0%及5.0%時(shí)能顯著提高黃顙魚特定生長(zhǎng)率、蛋白質(zhì)效率，提高黃顙魚對(duì)飼料的利用率，總體上看，添加高產(chǎn)乳酸芽孢桿菌對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)具有促進(jìn)效果。原因是產(chǎn)乳酸芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物包括多種氨基酸、酶類、乳酸等活性物質(zhì)，具促進(jìn)魚類消化吸收、修復(fù)腸道、增強(qiáng)動(dòng)物免疫等功能。

3.2 高產(chǎn)乳酸芽孢桿菌對(duì)黃顙魚血清非特異性免疫酶活力的影響

魚類的非特異性免疫機(jī)制在其防御外來病原入侵的過程中起著非常重要的作用。溶菌酶能破壞和消除侵入體內(nèi)的異物，從而擔(dān)負(fù)起機(jī)體防御的功能。超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶之一，可以清除體內(nèi)多余的自由基，與生物的免疫水平呈密切相關(guān)，也能反映動(dòng)物的抗應(yīng)激能力，因此這兩種酶是評(píng)判機(jī)體非特異性免疫力關(guān)鍵指標(biāo)。黃燕華等（2014）的研究表明，飼料中添加鼠李糖乳桿菌和糞腸球菌能顯著（P＜0.05）提高奧尼羅非魚免疫、抗氧化能力及抗嗜水氣單胞菌感染能力。劉小玲等（2013）的研究表明飼料中添加嗜酸乳酸菌可一定程度提高吉富羅非魚血清SOD和AKP活性，降低腸道中細(xì)菌總數(shù)，抑制大腸桿菌生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，添加了高產(chǎn)乳酸芽孢桿菌的BS-02、BS-10、BS-50 組黃顙魚非特異性免疫酶活力均高于對(duì)照組，其中BS-10溶菌酶活力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），BS-02超氧化物歧化酶活力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。推測(cè)原因主要由于高產(chǎn)乳酸芽孢桿菌可能會(huì)刺激魚類腸黏膜免疫的表達(dá)，從而提高了血清抗氧化和免疫力，特別是抗氧化能力，增強(qiáng)了魚機(jī)體的抗病原感染能力。