◆作者：董小英 朱原鋒 唐勝球

◆單位：韶關(guān)學(xué)院英東農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005

關(guān)鍵字：桔皮；精油；飼料；抑制霉菌活性

桔皮又稱陳皮，是蕓香科多種桔皮類的干燥果皮，我國(guó)資源豐富?，F(xiàn)代科學(xué)研究證明，桔皮所含有的一些成分具有抑制細(xì)菌、殺滅疥螨與蠅蚤等功效。近年來(lái)，日本農(nóng)業(yè)專家報(bào)道桔皮的揮發(fā)油有抑制霉菌的特殊效果，添加于飼料中，可延長(zhǎng)飼料的保質(zhì)期。

霉菌是飼料的主要污染物之一，在各種飼料產(chǎn)品中廣泛存在?，F(xiàn)已證實(shí)，霉菌生長(zhǎng)過程中所產(chǎn)生的天然代謝物——霉菌毒素，對(duì)飼料可產(chǎn)生諸多不良影響。據(jù)1996年國(guó)家飼料質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，從全國(guó)28個(gè)省、市、區(qū)104個(gè)飼料工業(yè)和飼養(yǎng)場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果表明，配合飼料污染率為100%，飼料原料為99%，參照國(guó)家飼料原料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，這些飼料可飼用的占80%，禁止飼用的占20%。為了控制飼料霉變，克服化學(xué)合成防霉劑的毒副作用大及殘留期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，許多國(guó)家已經(jīng)把目光轉(zhuǎn)向天然防霉劑的研究與開發(fā)方面。目前，有關(guān)桔皮精油防治飼料霉菌污染的研究少有報(bào)道。本試驗(yàn)通過對(duì)桔皮精油的提取、抑制霉菌試驗(yàn)，為新型生物性防霉劑的研究提供新的途徑。

柑橘皮精油主要成分為檸檬精油（limonene），可在常壓下被溶劑蒸餾出而不致分解。新鮮的柑橘皮中含有2%～3%的精油，它是食品香精、化妝品香精和香水配料的優(yōu)質(zhì)原料。食用香料植物提取物精油中含有多種低分子的抗菌物質(zhì)和抗氧化成分，作為果蔬類天然保鮮劑，能有效地抑菌防腐。這些低分子的抗菌物質(zhì)，如肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、桂醛、香茅醇、百里酚、丁香酚等，可抵抗大量的細(xì)菌、霉菌和酵母菌。莫小路（2004）等研究了作用濃度為0.7～4.0μL/mL的南方藥用植物香芋、廣藿香、大葉胺和蛇床的精油對(duì)6種植物病原真菌的抑制活性。結(jié)果表明，大葉胺、廣藿香和香芋精油對(duì)串珠鐮刀病毒、玉米彎孢霉菌等多種供試植物病原真菌的生長(zhǎng)有明顯抑制作用?？梢姡煌木蛯?duì)各病原真菌的抑制率有一定差異。目前，我國(guó)的桔皮精油基本靠進(jìn)口，提取桔皮精油常用的方法有壓榨法、溶劑浸提法和水蒸氣蒸餾法以及超臨界二氧化碳萃取技術(shù)。本研究將利用水蒸氣蒸餾法提取桔皮精油，通過濾紙片擴(kuò)散法測(cè)量桔皮精油對(duì)草酸青霉、煙曲霉、鐮型鐮刀菌和黃曲霉的最大抑菌圈直徑，分析桔皮精油的抑菌作用，并確定其最低抑菌濃度，為自然資源桔皮生產(chǎn)加工中副產(chǎn)物的綜合利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原材料

從市場(chǎng)購(gòu)買新鮮質(zhì)優(yōu)的桔子，去肉留皮備用。

1.1.2 指示菌

指示菌為草酸青霉、黃曲霉、煙曲霉、鐮刀菌等四種，由韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.1.3 試劑

主要試劑有70%酒精棉，無(wú)菌水，無(wú)菌生理鹽水，葡萄糖，瓊脂，牛肉膏，蛋白胨，氯化鈉，5%HCl溶液，5%NaOH溶液等。

1.1.4 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。具體配方：牛肉膏 5.0g，蛋白胨 10g，氯化鈉 5.0g，瓊脂 20.0g，水1000mL。加熱融化，調(diào) pH7.0～7.2，分裝，高壓濕熱滅菌（121℃，20min），備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)器材的消毒

使用立式壓力蒸汽滅菌器對(duì)所有的玻璃儀器進(jìn)行高壓滅菌處理。

1.2.2 桔皮精油的提取

①稱取300g新鮮桔皮，切成直徑為4mm大小的碎片于圓底燒瓶中，以2∶1放入蒸餾水。

②如圖1安裝好儀器，并在提取筒中加入蒸餾水直到流入燒瓶為止。

③加熱至沸騰，回流，精油隨同水蒸氣一起揮發(fā)，冷凝于提取器中。

④待提取器中油量不再增加時(shí)，停止加熱，冷卻。

⑤半個(gè)小時(shí)后，開啟提取器下活塞，將水緩緩放出至油層下降至“0”刻度，讀取精油的體積1.2mL，并保存以備用。

1.2.3 配制106cfu/mL的檢測(cè)菌懸液

用接種環(huán)取少許檢測(cè)菌分別接于5mL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h。取10支無(wú)菌試管，每支試管裝9mL無(wú)菌蒸餾水，滅菌后待用，在無(wú)菌條件下取1mL菌懸液到1號(hào)試管中，搖勻后再?gòu)?號(hào)試管中提取1mL放到2號(hào)試管中，依次重復(fù)，形成10個(gè)不同濃度的菌懸液，使用顯微鏡以紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)出菌體個(gè)數(shù)，取密度 106～107的菌懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 揮發(fā)油提取蒸餾裝置

1.2.4 濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈

將各種待測(cè)菌懸液各取0.10mL均勻涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面，制成含菌平板。將平板用彩筆平均劃分為4個(gè)區(qū)域，用滅菌后直徑為5.5 mm的圓形濾紙片蘸取一定體積分?jǐn)?shù)為桔皮精油分別輕輕地貼于四個(gè)區(qū)域，把所有置于培養(yǎng)箱中28℃下培養(yǎng)48h。每種菌做3個(gè)平行，選取抑菌圈比較明顯的平板測(cè)定抑菌圈直徑，結(jié)果取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.2.5 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，傾注于平板內(nèi)，冷卻后移取0.1mL大腸桿菌菌液、白色葡萄球菌菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面，將平板用彩筆平均劃分為4個(gè)區(qū)域，在兩組培養(yǎng)皿用圓形濾紙片分別蘸取體積分?jǐn)?shù)為1%、2%、4%、5%、6%、8%、10%、12%的桔皮精油輕輕地貼于8個(gè)區(qū)域內(nèi)，培養(yǎng)24h。將上述平板繼續(xù)培養(yǎng)24h，以最小抑菌圈直徑對(duì)應(yīng)的體積分?jǐn)?shù)作為該菌種的MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈的大小

通過測(cè)定桔皮精油對(duì)草酸青霉、黃曲霉、煙曲霉和鐮刀菌的抑菌圈直徑大小，比較精油對(duì)這4種菌的抑菌效果，結(jié)果見表1。

表1 柑橘皮精油對(duì)供試菌的抑菌圈直徑（mm）

抗菌素抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)是：抑菌圈直徑大于15mm時(shí)為高度敏感，10～15mm時(shí)為中度敏感，7～9mm時(shí)為低度敏感，無(wú)抑菌圈者為不敏感。根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)與上述數(shù)據(jù)表明，鐮刀菌對(duì)桔皮精油是高度敏感，草酸青霉和煙曲霉屬于中度敏感，而黃曲霉屬于低度敏感。

表2 桔皮精油對(duì)4中霉菌的情況比較（24h）

表3 桔皮精油對(duì)4中霉菌的情況比較（48h）

2.2 最低抑菌濃度的確定

培養(yǎng)基上霉菌生長(zhǎng)判斷標(biāo)準(zhǔn)：

“-”：斜面無(wú)霉菌生長(zhǎng)；

“±”：斜面邊緣有少量霉菌生長(zhǎng)；

“+”：斜面有少量散在菌落；

“++”；斜面基本布滿菌落，但生長(zhǎng)受到抑制；

“+++”；斜面基本長(zhǎng)滿菌落；

“++++”；斜面上菌落茂密生長(zhǎng)。

桔皮精油對(duì)4種霉菌的情況對(duì)比如下表2、表3。從下表可知，24h時(shí)，5～12%的桔皮精油可完全抑制4種霉菌的生長(zhǎng)。48h時(shí)，桔皮精油對(duì)黃曲霉抑制效力不佳，但對(duì)另外3種霉菌均有抑殺作用，其中4%～12%的桔皮精油即可完全抑制草酸青霉和鐮形鐮刀菌。

3 總結(jié)

霉菌是一種真菌，適應(yīng)能力強(qiáng)，在自然界中普遍存在。據(jù)有關(guān)資料報(bào)道，飼料和飼料原料中主要污染源為霉菌，其中以青霉屬、曲霉屬最普遍，其次為鐮刀菌屬，其檢出率分別為82.7%、74.0%、50.8%，因而本試驗(yàn)選擇草酸青霉、煙曲霉、鐮刀菌、黃曲霉作為試驗(yàn)菌種。試驗(yàn)結(jié)果表明，桔皮精油對(duì)上述4種霉菌均有不同程度的抑制作用。從表2、3可知桔皮精油24h觀察4%～5%可完全抑制4種霉菌。48h觀察對(duì)黃曲霉抑制效力不佳，對(duì)另外3種霉菌均有抑殺作用。研究結(jié)果提示，桔皮精油對(duì)霉菌的抑制作用，不僅有菌種特異性，還具有一定的時(shí)效。為此，在實(shí)際應(yīng)用中，一要注意桔皮精油抑制霉菌的時(shí)效和菌種差異性，才能取得好的防霉效果。

此外，為了使橘皮精油成分能更有效應(yīng)用于飼料中，有必要建立適用的關(guān)鍵控制評(píng)價(jià)方法，綜合飼料的抗菌效果和精油對(duì)飼料影響，優(yōu)化添加配方，結(jié)合保藏措施，使其更具實(shí)際應(yīng)用性。