王統(tǒng)苗，張莘，陳博雯，常國(guó)斌，白皓，江勇，張揚(yáng)，王志秀，陳國(guó)宏

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

中國(guó)是世界上鴨品種遺傳資源最為豐富的國(guó)家，但是由于外來品種的大量引入和雜交，許多地方品種資源急劇減少，我國(guó)地方鴨品種資源的保種迫在眉睫[1].對(duì)我國(guó)地方鴨品種遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，了解鴨品種的群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化，可以為保種和制作鴨產(chǎn)品提供新的思路[2].微衛(wèi)星是廣泛存在于真核生物基因組中的短串聯(lián)重復(fù)序列，在群體遺傳結(jié)構(gòu)、群體遺傳分化等方面廣泛使用[3]，目前微衛(wèi)星被用于遺傳多樣性研究方面的報(bào)道較多[4-5]，而在群體遺傳結(jié)構(gòu)方面的研究報(bào)道較少[6-7].

張揚(yáng)等[8]利用12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)我國(guó)保存的6個(gè)鴨品種進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)‘臨武鴨’與‘攸縣麻鴨’‘高郵鴨’與‘山麻鴨’和‘廣西小麻鴨’的遺傳距離較近；黃種彬等[9]對(duì)‘連城白鴨’‘莆田黑鴨’‘金定鴨’‘山麻鴨’和‘福建番鴨’等5個(gè)鴨品種遺傳結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)河鴨屬品種遺傳距離較近，與‘福建番鴨’親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；宋衛(wèi)濤等[10]使用微衛(wèi)星對(duì)蛋鴨品種遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)11個(gè)蛋鴨群體中都存在復(fù)雜遺傳基礎(chǔ)的個(gè)體.

本研究根據(jù)Pritchard[11]提出的多位點(diǎn)等位基因推斷群體遺傳結(jié)構(gòu)的模型分類法(Model-based clusterm ethod)-Structure程序?qū)?018年新發(fā)現(xiàn)的遺傳資源于‘田麻鴨’和‘潤(rùn)州鳳頭白鴨’，肉鴨代表品種‘北京鴨’‘櫻桃谷鴨’，藥用品種‘連城白鴨’，肉蛋兼用型品種‘吉安紅毛鴨’共180只進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，利用Fstat(V2.9.3)軟件進(jìn)行遺傳分化研究，旨為闡明于‘田麻鴨’和‘潤(rùn)州鳳頭白鴨’與其他4個(gè)鴨種的遺傳結(jié)構(gòu)關(guān)系，為地方鴨品種資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣本采集

6個(gè)地方鴨品種是‘潤(rùn)州鳳頭白鴨’(FT)(鎮(zhèn)江天成農(nóng)業(yè)科技有限公司)、‘連城白鴨’(LC)(福建省石獅國(guó)家級(jí)水禽基因庫(kù))、‘櫻桃谷鴨’(YT)(江蘇益客集團(tuán))、‘北京鴨’(BJ)(北京畜牧獸醫(yī)研究所)、‘吉安紅毛鴨’(JA)(江西省吉安紅毛鴨資源保種場(chǎng))、‘于田麻鴨’(YTM)(新疆于田縣)，公母各15只.

1.2 鴨基因組DNA提取

于鴨翅靜脈處采血，提取基因組DNA用傳統(tǒng)苯酚-氯仿法[12]，測(cè)定濃度和純度，稀釋到100 ng/L，于-20 ℃保存.

1.3 微衛(wèi)星位點(diǎn)

選擇16對(duì)多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星引物AJ2725-80、AJ515884、CMO11、AY493256、CMO12、AJ515-898、AY493249、AJ515893、SMO13、AJ515895、AJ-272578、SMO4、AJ272579、AY493295、AJ272577、APL2作為試驗(yàn)位點(diǎn).

1.4 STR分型測(cè)序

將PCR產(chǎn)物送到北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行STR分型測(cè)序.在ABI-3730XL DNA測(cè)序儀上檢測(cè)基因型，GeneMapper4.0軟件生成圖譜文件同時(shí)讀出片段長(zhǎng)度、峰高、峰面積，同時(shí)判斷純合子(單峰)或雜合子(雙峰).

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

依據(jù)微衛(wèi)星座位核心序列，對(duì)測(cè)序長(zhǎng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行矯正，使用Microsatellite-Toolkit軟件導(dǎo)出Fstat(V2.9.3)和Structure2.0軟件所需的數(shù)據(jù)文件.將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Structure2.0軟件，設(shè)群體的假定推斷類別數(shù)K值為2～6，K值為祖先群體.對(duì)每個(gè)K值，重復(fù)運(yùn)行10 000次，每次在10 000 Burn-in的基礎(chǔ)上運(yùn)行10 000步.估計(jì)的群體遺傳結(jié)構(gòu)圖由Bar Plot程序獲得；NJ圖由Tree Plot程序獲得，獨(dú)立類群圖由Triangle Plot程序獲得.每個(gè)K值下，用關(guān)鍵參數(shù)log(Alpha)的實(shí)時(shí)波動(dòng)來檢測(cè)Structure程序重復(fù)運(yùn)行的連續(xù)性和可靠性.

1.6 統(tǒng)計(jì)原理

F-統(tǒng)計(jì)量包括總近交系數(shù)(Fit)、群體分化系數(shù)(Fis)、群體內(nèi)近交系數(shù)(Fst)等3個(gè)參數(shù).

1-Fst=(1-Fis)×(1-Fit)

式中，Ho：觀察雜合度；Hs：平均期望雜合度.

2 結(jié)果與分析

2.1 等位基因數(shù)目在群體中的分布

16個(gè)微衛(wèi)星座位在6個(gè)群體中共檢測(cè)到141個(gè)等位基因，見表1.所有座位在6個(gè)鴨群體中檢測(cè)到多個(gè)等位基因，表現(xiàn)為中高度多態(tài)性.其中，AY493256、AY493295、APL2座位等位基因最多，均為13個(gè)；CMO11、SMO13的等位基因最少，均為5個(gè).對(duì)于6個(gè)鴨群體來說，‘于田麻鴨’的等位基因最多，其次為‘櫻桃谷鴨’‘吉安紅毛鴨’‘潤(rùn)州鳳頭白鴨’含有的等位基因最少.各個(gè)位點(diǎn)的等位基因在6個(gè)鴨群體中分布均勻，能較好地反映6個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)特性.

2.2 F-統(tǒng)計(jì)量的估計(jì)

表2為16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在6個(gè)鴨群體的F-統(tǒng)計(jì)量，16個(gè)SSR座位在6個(gè)群體內(nèi)的固定系數(shù)(Fst)在0.049～0.325之間變動(dòng)，其中位點(diǎn)AJ272578最低，位點(diǎn)AJ272577最高，平均值為0.210；6個(gè)群體的個(gè)體固定系數(shù)(Fit)的范圍為0.17～0.774，最低的位點(diǎn)仍是位點(diǎn)AJ272578，但最高的位點(diǎn)為SMO13;整個(gè)群體的個(gè)體的近交系數(shù)(Fis)的范圍為-0.029～0.689，其中位點(diǎn)AJ272580和AJ272577為負(fù)值，顯示為雜合子過剩，其他位點(diǎn)都顯示為雜合子缺失.

表1 16個(gè)座位上的等位基因數(shù)目及其分布

表2 16個(gè)微衛(wèi)星座位在6個(gè)鴨群體內(nèi)的F-統(tǒng)計(jì)量

平均值來自Jackknife,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

Mean estimates from Jack knife over loci，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001.

2.3 我國(guó)地方鴨品種群體類別推斷

在假定群體的類別值K下，用log(Alpha)主要關(guān)鍵參數(shù)的實(shí)時(shí)波動(dòng)來檢測(cè)運(yùn)行Structure程序的連續(xù)性和可靠性.由圖2可見，log(Alpha)曲線圖檢測(cè)值穩(wěn)定，幅度變化小，說明Structure程序構(gòu)建的群體結(jié)構(gòu)圖穩(wěn)定可靠.運(yùn)用貝葉斯概率理論(Bayesian theory)，使用Structure程序?qū)Σ蓸拥?80個(gè)個(gè)體進(jìn)行鑒定.Structure程序還可以依據(jù)個(gè)體基因組分?jǐn)?shù)推測(cè)遷移個(gè)體和是否具有復(fù)雜遺傳基礎(chǔ)的個(gè)體(基因組分?jǐn)?shù)<0.800).結(jié)果表明，6個(gè)地方鴨品種群體概率值，‘于田麻鴨’最低為67.2%，‘連城白鴨’最高為85.3%，其他品種概率值在71.4%～82.2%之間.群體平均基因組分?jǐn)?shù)分布見表3.‘于田麻鴨’‘北京鴨’和‘櫻桃谷鴨’有遷移個(gè)體，‘潤(rùn)州鳳頭白鴨’‘連城白鴨’和‘吉安紅毛鴨’無遷移個(gè)體.

表3 6個(gè)群體基因組分?jǐn)?shù)在推斷類別(K=6)中的分布

2.4 基于Structure程序分析群體間系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

圖1顯示，在K=2時(shí)，所有個(gè)體被Structure程序分為2個(gè)亞群，‘潤(rùn)州鳳頭白鴨’‘連城白鴨’‘于田麻鴨’構(gòu)成一個(gè)亞群，‘北京鴨’‘櫻桃谷鴨’‘吉安紅毛鴨’構(gòu)成另一個(gè)亞群.當(dāng)K=3時(shí)，6個(gè)品種被推斷為3個(gè)亞群，此時(shí)‘于田麻鴨’被單獨(dú)分離出來.當(dāng)K=4時(shí)，‘于田麻鴨’和‘吉安紅毛鴨’分開，形成了2個(gè)獨(dú)立群體，其他4個(gè)群體仍未發(fā)生分離.K=5時(shí)，‘潤(rùn)州鳳頭白鴨’‘北京鴨’‘連城白鴨’‘于田麻鴨’成為獨(dú)立類群.當(dāng)K=6時(shí)，‘櫻桃谷鴨’和‘吉安紅毛鴨’各自成為獨(dú)立類群，最終形成6個(gè)獨(dú)立群體.在6個(gè)群體獨(dú)立類群圖中，K=4時(shí)，‘連城白鴨’(Cluster4)和‘櫻桃谷鴨’(Cluster 2)分成2個(gè)獨(dú)立的類群，見圖3左側(cè)獨(dú)立類群分布圖；當(dāng)K=5時(shí)，‘潤(rùn)州鳳頭白鴨’(Cluster1)和‘連城白鴨’(Cluster4)發(fā)生分離，形成獨(dú)立類群，見圖3中間獨(dú)立類群分布圖；當(dāng)K=6時(shí)，‘連城白鴨’(Custer4)和‘于田麻鴨’(Cluster6)發(fā)生分離，見圖3右側(cè)獨(dú)立類群分布圖.

由Structure程序得到的系統(tǒng)聚類圖(圖4)，‘潤(rùn)州鳳頭白鴨’‘于田麻鴨’和‘櫻桃谷鴨’聚為一類，‘北京鴨’‘連城白鴨’和‘吉安紅毛鴨’聚為一類.

圖1 Structure程序推斷的群體結(jié)構(gòu)圖 Figure 1 Structure program of population structure

3 討論

3.1 群體內(nèi)遺傳多樣性分析

本文選擇16對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)我國(guó)地方6個(gè)鴨品種進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化研究.16個(gè)位點(diǎn)多態(tài)信息含量豐富，能夠顯示這6個(gè)品種的遺傳多樣性信息，進(jìn)而可以描述這6個(gè)品種間的遺傳結(jié)構(gòu)關(guān)系.

圖2 Structure運(yùn)行時(shí)的log(Alpha)參數(shù)的時(shí)實(shí)變化圖 Figure 2 The real-time change of the log (Alpha) parameter of the structure runtime

圖3 各群體的獨(dú)立類群分布Figure 3 Distribution of independent groups of each group

圖4 Structure程序構(gòu)建的群體NJ樹Figure 4 The community NJ tree constructed by the Structure program

3.2 群體間的遺傳變異

F-統(tǒng)計(jì)量結(jié)果顯示群體間存在明顯的遺傳分化，群體間的遺傳差異有21%來自群體間的差異，79%的變異來自個(gè)體間的差異，可能由于這6個(gè)品種之間相隔距離較遠(yuǎn)，致使其群體間基因分化系數(shù)比較大.此結(jié)果高于宋衛(wèi)濤等[10]計(jì)算的11個(gè)蛋鴨品種的分化系數(shù)(12%)；低于李慧芳等[13]統(tǒng)計(jì)的華東區(qū)鴨品種間的分化系數(shù)(25.65%).

3.3 群體系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析

Structure程序以貝葉斯概率理論為基礎(chǔ)，采用馬爾可夫-Monte Carlo模擬算法.當(dāng)程序運(yùn)行時(shí)，采用混合模型來設(shè)置檢測(cè)到的群體的編號(hào)K[14].利用Structure程序?qū)ξ覈?guó)地方6個(gè)地方鴨品種群體進(jìn)行群體分析，當(dāng)K=6時(shí)，可以明顯地將我國(guó)6個(gè)地方鴨品種區(qū)分開，說明K=6是最佳K值，這與張揚(yáng)等[8]的研究結(jié)果一致；獨(dú)立類群分布圖可以看出‘連城白鴨’始終可以與其他5個(gè)鴨品種分離.NJ圖顯示‘于田麻鴨’和‘潤(rùn)州鳳頭白鴨’聚為一類，‘于田麻鴨’是新疆地方品種，是由野鴨自然交配而形成,和‘潤(rùn)州鳳頭白鴨’聚為一類，因?yàn)檫@2種鴨都是由野鴨進(jìn)化而來；‘北京鴨’與‘櫻桃谷鴨’聚為一類，‘櫻桃谷鴨’是‘北京鴨’與英國(guó)當(dāng)?shù)仄贩N雜交而培育出來的新品種，含有大部分‘北京鴨’的血液，且是肉用型的品種[5]，所以它們聚為一類.

本研究通過16個(gè)多態(tài)性較好的微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)中國(guó)地方6個(gè)鴨品種進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)性和遺傳分化研究，為我國(guó)地方鴨品種間的遺傳信息和遺傳關(guān)系提供更準(zhǔn)確的依據(jù)，為合理開發(fā)利用并且保存各品種優(yōu)良性狀提供可靠的信息.