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(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部東海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200090)

南極磷蝦資源量巨大,營(yíng)養(yǎng)豐富,蛋白質(zhì)含量高達(dá)干樣的60%～65%,且必需氨基酸齊全,是一種優(yōu)質(zhì)動(dòng)物性蛋白質(zhì)[1-2]。南極磷蝦蛋白資源大多用于鮭、鱒魚(yú)類人工配合飼料中魚(yú)粉的替代蛋白源、觀賞魚(yú)飼料添加劑以及游釣業(yè)[3-4],開(kāi)發(fā)利用南極磷蝦資源意義重大[1]。近年來(lái),學(xué)者們從南極磷蝦內(nèi)陸續(xù)提取了磷蝦油、蛋白水解酶、磷蝦肽等功能性物質(zhì)[5-7]。李明杰等[7]指出不同蛋白酶水解所得的南極磷蝦酶解液具有一定的清除自由基的能力。游離氨基酸(free amino acid,FAA)又稱為非蛋白氨基酸,是酶水解物主要營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì),其含量及特定比例組合直接影響其滋味特征。目前的研究中尚未涉及對(duì)南極磷蝦經(jīng)不同外源蛋白水解酶制備的酶解液中游離氨基酸及多肽相關(guān)報(bào)道,僅見(jiàn)任艷[8]對(duì)南極磷蝦蛋白的水解液中游離氨基酸組成的簡(jiǎn)略報(bào)道。

本文利用復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶及木瓜蛋白酶對(duì)南極磷蝦進(jìn)行水解,對(duì)酶解液中游離氨基酸組成特點(diǎn)、營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)、游離氨基酸的呈味貢獻(xiàn)對(duì)比及肽相對(duì)分子量分布進(jìn)行分析,探討南極磷蝦酶解液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味特征及多肽組成的特點(diǎn),從而為南極磷蝦酶解液作為功能食品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦 由我國(guó)南極海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用項(xiàng)目組于2015年1月南極FAO 48.1區(qū)捕撈,2015年4月冷凍條件下運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室,保存于-40 ℃冰箱中;木瓜蛋白酶(Papain) 酶活22000 U/g,中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司(沃凱,進(jìn)口分裝);復(fù)合蛋白酶(Protamex)、堿性蛋白酶(Alacalase 2.4 L)、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme 500 M G) 酶活分別為56000 U/g、110000 U/mL、48000 U/g,諾維信公司;乙腈 光譜純,Merck公司;甲酸 色譜純,天律市光復(fù)精細(xì)化工研究所;Tri-sephosphate isomerase(Mw=26625 Da)、Myoglobin(Mw=16950 Da)、Aprotinin(Mw=6512 Da)、Insulin-B(Mw=3496 Da)、Bacitracin(Mw=1423 Da) 美國(guó)Bio-rad公司;馬尿酰組氨酰亮氨基酸(hippuryl-histidyl·leucine,HHL,Mw=423 Da) 日本Peptide Institute;18種氨基酸標(biāo)品 中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)試劑研究所。

IKA T50高速勻漿機(jī) 德國(guó)IKA;CF 16XII高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司;PHSJ-3F 實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;FOSS KjeltecTM2200凱氏定氮儀 瑞典福斯FOSS公司;Waters 600E高效液相色譜 美國(guó)Waters公司;L-8500氨基酸自動(dòng)分析儀 日本Hitachi公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶解液的制備 將500 g冰凍南極磷蝦于4 ℃冰箱中解凍4 h,用勻漿機(jī)將其攪碎成糜狀,分別稱取10 g南極磷蝦糜于50 mL離心管中,加入10 mL的蒸餾水,搖勻后根據(jù)蝦糜質(zhì)量按照500 U/g蝦糜鮮重的添加比例加入木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶,攪拌均勻,置于恒溫振蕩器中水解4 h,酶解條件見(jiàn)表1。待酶解結(jié)束,在沸水浴中煮沸滅酶活10 min,冷卻后,12000 r/min 4 ℃離心30 min,澄清的上清液定容到20 mL,即為實(shí)驗(yàn)所得各組酶解液(木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶解、堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶所得酶解液分別記為MKPEH、PKPEH、AKPEH和FKPEH),每種蛋白水解酶的酶解反應(yīng)設(shè)3組平行。

表1 南極磷蝦蛋白酶解參數(shù)Table 1 Parameters for enzymatic hydrolysis of Antarctic krill protein

1.2.2 氨基酸標(biāo)樣 天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、絲氨酸(Set)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)均用0.01 mol/L鹽酸配制成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.3 酶解液水解度的測(cè)定 酶解上清液中總氮含量采用凱氏定氮法[9],上清液中的氨基酸態(tài)氮含量采用甲醛電位滴定法[10]測(cè)定。水解度(degree of hydrolysis,DH)見(jiàn)式(1)[11]。

DH(%)=酶解液中氨基態(tài)氮含量/原料中總氮含量×100

式(1)

1.2.4 氮收率和平均肽鏈長(zhǎng)度(average peptide length,APL)的測(cè)定 酶解液中總氮含量占原料總氮的百分比為氮收率,反應(yīng)的是水解效率,指在酶解時(shí)間內(nèi),變性蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)酶解轉(zhuǎn)化為可溶性的氮的能力,見(jiàn)式(2)[12]。

氮收率(%)=(T-N)/(RMT-N)×100

式(2)

式中:T-N為酶解液中總氮含量,mg;RMT-N為原料總氮含量,mg。

酶解液中平均肽鏈長(zhǎng)度(average peptide length,APL)計(jì)算見(jiàn)式(3)[13]。

APL=(T-N)/(A-N)

式(3)

式中:T-N為酶解液中總氮含量,mg;A-N為酶解液中氨基態(tài)氮含量,mg。

1.2.5 游離氨基酸測(cè)定 取1 mL酶解液樣品,不經(jīng)酸堿水解,直接加水定容至1000 mL,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后上樣至氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定[14],取樣量可視含量高低而定,待測(cè)液?jiǎn)畏N氨基酸濃度<1 μg/mL為宜。

1.2.6 滋味貢獻(xiàn)評(píng)價(jià)方法 采用呈味強(qiáng)度值(Taste activity value,TAV)法評(píng)價(jià)單個(gè)游離氨基酸對(duì)不同酶解液滋味的貢獻(xiàn),TAV 指樣品中各呈味物質(zhì)的測(cè)定值與該物質(zhì)味道閾值之比,通常認(rèn)為,當(dāng)TAV 大于1時(shí),該物質(zhì)對(duì)樣品呈味有重要影響,并且數(shù)值越大,貢獻(xiàn)越大[15]。計(jì)算見(jiàn)式(4)。

TAV=C1/C2

式(4)

式中:C1為滋味化合物的質(zhì)量濃度,mg/mL;C2為滋味閾值濃度,mg/mL。

1.2.7 分子量分布的測(cè)定 采用高效凝膠排阻色譜柱技術(shù)對(duì)酶解液中多肽分子量大小和肽段組成模式進(jìn)行測(cè)定[16]。色譜條件如下:色譜柱:TSK gel G200SWXL,流動(dòng)相:50 mmol/L Tris-HC1緩沖液(pH7.2),上樣量:20 μL,流動(dòng)相流速:0.7 mL/min,監(jiān)測(cè)214 nm處的吸光值。

標(biāo)曲的建立:將6種標(biāo)準(zhǔn)多肽(Tri,osephosphate-isomerase、Myoglobin、Aprotinin、Insulin-B、Bacitracin)和HHL配制成溶液(1 mg/mL),進(jìn)行高效液相色譜洗脫,建立分子量的對(duì)數(shù)與洗脫保留時(shí)間之間的回歸方程。相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值與洗脫體積擬合直線方程為y=-1.7549x+13.842(R2=0.9937),其中,y為標(biāo)準(zhǔn)肽分子量對(duì)數(shù),x為洗脫體積。

南極磷蝦酶解液上樣處理:將南極磷蝦酶解液配制可溶性蛋白含量為5 mg/mL的溶液,經(jīng)過(guò)針式過(guò)濾頭(0.45 μm)過(guò)濾后，在相同的條件下進(jìn)行高效液相色譜洗脫,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA),Duncan多重比較和獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),數(shù)據(jù)以M±SD表示,p<0.05為差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 DH、APL和氮收率

如表2,AKPEH水解程度最高。由于各蛋白酶的作用類型和內(nèi)切活力與外切活力的比值上存在差異,堿性蛋白酶是比較適合南極磷蝦蛋白的外源蛋白水解酶。Liaset等[17]的報(bào)道指出,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的蛋白類食物應(yīng)富含低分子肽,尤其是二肽和三肽,同時(shí)又盡可能少含游離氨基酸。4種酶解液中平均肽鏈長(zhǎng)為1.41～1.62個(gè)氨基酸殘基,是含少量游離氨基酸的小肽混合物,有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。酶解條件對(duì)酶解產(chǎn)物的氮收率有一定的影響[12],結(jié)果表明,不同的外源蛋白酶種類對(duì)南極磷蝦酶解產(chǎn)物的氮收率也有一定的影響。FKPEH的氮收率顯著低于其余3組酶解液(p<0.05),說(shuō)明其酶解效率在4種酶解液中最低。

表2 4種酶解液的水解度、平均肽鏈長(zhǎng)度及氮收率(n=3)Table 2 DH,APL and nitrogen yield of four krill protein enzyme-hydrolysates(n=3)

2.2 南極磷蝦酶解液游離氨基酸分析

2.2.1 南極磷蝦酶解液游離氨基酸中常見(jiàn)氨基酸組成分析 采用氨基酸測(cè)定儀對(duì)4種酶解液中FAA組成進(jìn)行分析,檢測(cè)到18種常見(jiàn)氨基酸(見(jiàn)表3)。MKPEH、PKPEH、AKPEH和FKPEH中18種常見(jiàn)游離氨基酸總量(total free amino acids,∑TFAA)分別為22.95、22.24、24.94和21.77 mg/mL;且AKPEH的∑TFAA顯著高于FKPEH(p<0.05),MKPEH和PKPEH的∑TFAA分別與AKPEH和FKPEH中∑TFAA無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著差異(p>0.05)。本研究結(jié)果與沈雨佳等[18]的報(bào)道結(jié)果相反,在鯽魚(yú)肉酶解液中,風(fēng)味蛋白酶酶解液的∑TFAA最高(22.1 mg/mL),堿性蛋白酶酶解液的∑TFAA最低(5.28 mg/mL),木瓜蛋白酶酶解液的∑TFAA居中(10.11 mg/mL)。因酶解產(chǎn)物中游離氨基酸組成與原料特性有一定的關(guān)系,南極磷蝦為海水甲殼類動(dòng)物蛋白,而鯽魚(yú)為淡水魚(yú)類動(dòng)物蛋白,因此南極磷蝦酶解液游離氨基酸組成與鯽魚(yú)酶解液存在差異可能與酶解底物蛋白組成不同有關(guān)。

從單一氨基酸檢測(cè)結(jié)果上看(表3),4種酶解液中含量較高的游離氨基酸種類有Leu、Arg、Val、Ala和Glu,但不同蛋白酶酶解液中游離氨基酸含量高低順序有所不同。Leu在MKPEH、PKPEH和FKPEH中的含量最高,其次是Arg,而AKPEH中,Glu含量最高,其次是Leu和Arg,且4種酶解液中,Val含量皆高于Ala。4種酶解液中,Glu含量各不相同,Glu含量從高到低依次為AKPEH、PKPEH、FKPEH、MKPEH。同一批制備的南極磷蝦蛋白肉糜,主要氨基酸分布情況基本一致,但因所采用的外源蛋白酶種類不同,所得的酶解物中游離氨基酸含量高低順序存在差異;不同的蛋白酶具有各自的特異性及優(yōu)先酶切位點(diǎn),對(duì)同種原料進(jìn)行酶解后所得的酶解產(chǎn)物中游離氨基酸組成會(huì)有不同程度的差異[19]。與鯽魚(yú)肉[18]、白鰱魚(yú)骨[20]、縊蟶[21]及鳀魚(yú)[22]酶解液中含量最豐富的游離氨基酸占其∑TFAA的百分比特別高的氨基酸組成模式不同,4種南極磷蝦酶解液中含量豐富的氨基酸種類在∑TFAA中所占百分比較為均衡(7.00%～10.00%)。游麗君[23]的研究表明,水解度不同,酶解產(chǎn)物中游離氨基酸的含量及組成存在一定差異。由于水解程度各不相同,因此水產(chǎn)動(dòng)物蛋白酶解產(chǎn)物中優(yōu)勢(shì)游離氨基酸種類不一致的原因除了與酶解底物蛋白源不同外,還與水解度有關(guān)。

表3 4種酶解液中游離氨基酸分類及含量Table 3 Classification and content of free amino acids of four krill protein enzyme-hydrolysates

與其他水產(chǎn)動(dòng)物蛋白酶解產(chǎn)物中優(yōu)勢(shì)游離氨基酸種類相比,木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶解鯽魚(yú)肉所得酶解液中的游離氨基酸中含量最豐富的是Leu(分別為19.13%、18.14%和20.77%)[18]。而姜紹通等[20]使用中性蛋白酶對(duì)白鰱魚(yú)骨酶解所得的酶解液中,含量最豐富的游離氨基酸種類分別是Tyr(26.93%)。李瑩等[21]用堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解縊蟶肉所得水解液中游離氨基酸含量最豐富的是Lys(18.87%)。朱碧英等[22]用胃蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)配酶解鳀魚(yú)所得水解液中游離氨基酸含量最豐富的是Glu(17.33%)。由此可見(jiàn),酶解底物蛋白源不同,即使采用同一種外源蛋白水解酶,所得酶解液中含量豐富的游離氨基酸種類也不同。

Hughes等[24]和耿翠竹等[25]發(fā)現(xiàn)疏水性氨基酸是酶解液中的主要的氨基酸。南極磷蝦蛋白的4種酶解液中,疏水性氨基酸(Ala、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr和Pro)是主要的氨基酸種類,本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相符。

2.2.2 游離氨基酸中常見(jiàn)氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值分析 必需氨基酸(essential amino acids,EAA:Trp、Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys)利于人體吸收利用,其含量越高,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越高。表3中,AKPEH中∑EAA顯著高于FKPEH中∑EAA(p<0.05),而MKPEH、PKPEH中∑EAA與AKPEH和FKPEH中∑EAA無(wú)顯著差異(p>0.05);AKPEH和PKPEH中∑EAA在∑TFAA中所占百分比(49.74%和49.57%)顯著高于MKPEH和FKPEH中∑EAA百分比(48.73%、48.39%)(p<0.05),4種酶解液中∑EAA在∑TFAA中所占百分比(48.39%～49.74%)均高于WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)(35.3%),與斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)魚(yú)頭水解粉中對(duì)應(yīng)值(48.26%)相當(dāng)[26],高于白鰱魚(yú)骨酶解液中的對(duì)應(yīng)值(31.44%)[20],但低于鯽魚(yú)肉酶解液中的對(duì)應(yīng)值(54.6%～65.02%)[18]。

AKPEH中∑DAA(Asp、Glu、Gly和Ala)顯著高于MKPEH(p<0.05),但AKPEH中∑DAA與PKPEH、FKPEH中∑DAA、MKPEH中∑DAA與PKPEH、FKPEH中∑DAA均無(wú)顯著差異(p>0.05)。4種酶解液∑DAA在∑TFAA中百分比與4種酶解液∑DAA的變化趨勢(shì)不同。FKPEH中∑DAA占∑TFAA百分比最高,顯著高于PKPEH、AKPEH中∑DAA百分比(p<0.05),而PKPEH、AKPEH中∑DAA百分比顯著高于MKPEH中∑DAA百分比(p<0.05)。

F值(Fischer ratio)是支鏈氨基酸(Branched chain amino acid,BCAA:Val、Ile、Leu)與芳香族氨基酸(Aromatic amino acid,AAA:Tyr、Phe)含量的克分子數(shù)比值,可作為評(píng)價(jià)蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的指標(biāo)之一[2,27],且支芳比(F值)越大其生理功能[28]越好。表3中可以看出,MKPEH的F值(2.03)顯著低于其于3組酶解液(3.32、3.28、3.49),且AKPEH、PKPEH、FKPEH的F值較南極磷蝦全蝦的F值(2.28)[13]顯著提高(p<0.05)。

因此,綜合∑TFAA、∑EAA、∑EAA/∑TFAA∑DAA、∑DAA/∑TFAA和F值對(duì)比分析,對(duì)南極磷蝦而言,酶解液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值從高到低依次為:AKPEH>PKPEH>FKPEH>MKPEH。

2.3 酶解液呈味特性及TAV分析

研究表明,植物或動(dòng)物蛋白酶解或發(fā)酵所獲得的大多數(shù)肽組分具備強(qiáng)烈的鮮味,對(duì)酶解液中的鮮味形成作用很大[29]。根據(jù)氨基酸的呈味特性,將其分為鮮味、甜味、苦味三種[30-31]。如表4,在已知味道閾值的氨基酸中,MKPEH、AKPEH和FKPEH中,除4種氨基酸(Asp、Ser、Pro、Thr)的TAV值小于1外,有11種氨基酸的TAV值大于1,其中TAV值最高的4種氨基酸分別是Glu、Val、Arg、Met。PKPEH中,除了Asp、Ser、Pro、Thr外,Gly(0.99)的TAV值亦小于1,TAV值最高的4種氨基酸與MKPEH中相同。

表4 4種南極磷蝦酶解液中呈味游離氨基酸TAVTable 4 The taste activity values of free amino acids in 4 kinds of four Antarctic krill protein enzyme-hydrolysates

2.3.1 鮮味氨基酸 Glu和Asp是呈鮮味的特征氨基酸,普遍認(rèn)為Glu對(duì)風(fēng)味起到的作用最大,Glu和Asp本身雖具有酸味,但它們的鈉鹽都具有鮮味,因此稱這兩種氨基酸為鮮味氨基酸。鮮味氨基酸除能產(chǎn)生鮮味外,還能增強(qiáng)食品滋味的持續(xù)性、復(fù)雜性、厚度等及食品的特征風(fēng)味和甜味[32]。如表5,4種酶解液中鮮味氨基酸組分在∑TFAA中百分比從高到低:FKPEH(13.27%)>AKPEH(13.04%)>PKPEH(12.34%)>MKPEH(10.15%),南極磷蝦酶解液中鮮味氨基酸組分比例高于雞湯酶解液中比例(8.83%)[30]。Glu可增加水解的鮮味,南極磷蝦酶解液中Glu的TAV值最高,而Asp的TAV值并不高,均小于1,因此Glu是南極磷蝦酶解液中重要的鮮味劑,且Glu對(duì)南極磷蝦酶解液鮮味的貢獻(xiàn)大于Asp。

表5 4種南極磷蝦酶解液中呈味氨基酸含量及占游離常見(jiàn)總氨基酸的比例Table 5 The contents and the proportion of flavor amino acids in total free amino acids of four Antarctic krill protein enzyme-hydrolysates

Glu是4種酶解液中單一氨基酸含量占∑TFAA百分比前五位的氨基酸種類之一,AKPEH中Glu含量在∑TFAA中所占百分比排第一,顯著高于其余3種酶解液中對(duì)應(yīng)值(p<0.05)。

2.3.2 甜味氨基酸 Gly、Ala、Ser、Pro和Thr是帶甜味特征的氨基酸。如表5,4種南極磷蝦酶解液中甜味氨基酸組分在∑TFAA中百分比較為接近(28.80%～30.24%),百分比按高低順序排序?yàn)?FKPEH(30.24%)>AKPEH(29.49%)>PKPEH(29.47%)>MKPEH(28.80%)。南極磷蝦酶解液中甜味氨基酸組分比例明顯高于雞湯酶解液中比例(16.13%)[30]。Ala是重要的甜味氨基酸,與Glu等鮮味物質(zhì)相互作用具有提鮮效果[33]。Gly本身具有爽快的甜味,除了本身提供的清香甜味以外,還能減少苦味,從食物中去除不良的口味[34],一般認(rèn)為Gly對(duì)風(fēng)味的作用次于Glu。Gly和Ala對(duì)蟹、蝦等水產(chǎn)品有重要貢獻(xiàn)[35]。王曜等[36]認(rèn)為,養(yǎng)殖克氏原螫蝦蝦肉中游離氨基酸中Ala的TAV值(1.48)高于野生克氏原螯蝦蝦肉中游離氨基酸中Ala的TAV值(0.99),這是養(yǎng)殖克氏原螯蝦蝦肉比野生克氏原螯蝦蝦肉味道更鮮甜的原因之一。表4中,南極磷蝦酶解液中Ala的TAV值(2.92～3.13)明顯高于克氏原螯蝦蝦肉中游離氨基酸中Ala的TAV值,表示南極磷蝦酶解液鮮甜味優(yōu)于克氏原螯蝦肉。此外,南極磷蝦酶解液中Gly的TAV值(0.99～1.03)低于海蜇皮香料基液中Gly的TAV值(2.47)[37],而南極磷蝦酶解液中Ala的TAV值(2.92～3.13)高于海蜇皮香料基液中Ala的TAV值(1.81)。這說(shuō)明,Ala對(duì)南極磷蝦酶解液甜味的貢獻(xiàn)高于Gly,而Gly對(duì)海蜇皮香料基液風(fēng)味的貢獻(xiàn)高于Ala。此外,Ser、Pro和Thr也具有甜味,但由于它們的TAV值較小(均小于1),所以對(duì)酶解液的甜味貢獻(xiàn)不如Ala和Gly。

從鮮、甜味氨基酸角度來(lái)看,FKPEH風(fēng)味優(yōu)于AKPEH和PKPEH,MKPEH風(fēng)味相對(duì)最差。

2.3.3 苦味氨基酸 4種酶解液中主要的苦味氨基酸是Tyr、Phe、Val、His、Lys、Arg、Met、Ile、Leu,共計(jì)9種。表5中苦味氨基酸組分在∑TFAA中百分比從高到低:MKPEH(59.05%)>PKPEH(55.89%)>AKPEH(55.08%)>FKPEH(54.34%)。南極磷蝦酶解液中苦味氨基酸組分比例明顯低于雞湯(56.81%)及雞湯酶解液比例(72.60%)[30]。

見(jiàn)表4,9種苦味氨基酸的TAV均大于1,其中Val、Arg和Met的TAV值較高,其次是His和Lys。天然Arg以L型存在,是一種苦味氨基酸,也是半必需氨基酸,Arg本身雖顯苦味,但并不是苦味的貢獻(xiàn)者,有增加呈味復(fù)雜性和提高鮮度的作用[37]。甲殼綱動(dòng)物中FAA的突出特點(diǎn)是存在大量的Ala、Arg及Glu[38],因此Arg能夠賦予海鮮一個(gè)適宜的整體風(fēng)味[35]。王曜等[36]研究指出,Arg對(duì)克氏原螯蝦蝦肉呈味貢獻(xiàn)顯著(TAV值6.77)。還有研究指出,Arg與扇貝、雪蟹、短頸文蛤等海產(chǎn)品的特征風(fēng)味有關(guān)[39]。陳德慰[40]檢測(cè)出文蛤和波紋巴非蛤中的游離精氨酸的TAV值分別為1.5和2.3,說(shuō)明Arg對(duì)這兩種貝肉的呈味有貢獻(xiàn)作用。南極磷蝦酶解液中Arg的TAV值(4.08～4.47)是TAV值中第三高的種類,猜測(cè)Arg對(duì)南極磷蝦酶解液的風(fēng)味具有重要的貢獻(xiàn)。Arg不僅能夠提升海產(chǎn)品及其酶解液的鮮度,并增加呈味復(fù)雜性,在人體營(yíng)養(yǎng)代謝與調(diào)控過(guò)程中也發(fā)揮重要作用,如Arg是維持嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的氨基酸,有多種獨(dú)特的生理和藥理作用[41]。因此,富含Arg的南極磷蝦酶解液可作為功能性食品基料用于保健藥及保健食物中。

除了主要鮮味物質(zhì)外,有研究者認(rèn)為His是魚(yú)味特征風(fēng)味的貢獻(xiàn)者[42],南極磷蝦酶解液中His的TAV值較高(2.28～3.57),推測(cè)其對(duì)南極磷蝦酶解液風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

從苦味氨基酸角度來(lái)看,FKPEH、AKPEH和PKPEH風(fēng)味相近,MKPEH風(fēng)味相對(duì)最差。

FAA可作為滋味物質(zhì)直接刺激人們的味覺(jué)器官,讓人感覺(jué)到鮮美,但鮮美滋味并不是由單一種類的氨基酸決定的,味道的鮮美程度與食品中呈味氨基酸(谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、脯氨酸)的組成和含量有關(guān)[43],其中鮮味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸等不同種類游離氨基酸之間的平衡及相互影響是決定滋味的關(guān)鍵因素之一[44]。從表4可知,南極磷蝦酶解液游離氨基酸中,鮮甜味氨基酸組分在∑TFAA中百分比含量較高,達(dá)38.95%～43.50%,百分比從高到低依次為FKPEH>AKPEH>PKPEH>MKPEH,苦味氨基酸組分在∑TFAA中所占百分比從高到低依次為MKPEH>PKPEH>AKPEH>FKPEH。綜合以上分析,南極磷蝦的4種酶解液的鮮甜味評(píng)分較高,且就總體風(fēng)味而言,FKPEH和AKPEH風(fēng)味優(yōu)于PKPEH,MKPEH風(fēng)味相對(duì)最差。Glu、Arg、Ala、Gly和His是對(duì)南極磷蝦酶解液風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的氨基酸種類。

2.4 南極磷蝦酶解液中多肽組成模式分析

見(jiàn)表6,南極磷蝦酶解液中肽的相對(duì)分子質(zhì)量呈不連續(xù)分布,除AKPEH外,MKPEH、PKPEH、FKPEH中含有微量的100個(gè)氨基酸(AA)以上的大分子肽段。南極磷蝦酶解液中含有少量游離氨基酸(2.13%～3.69%)。南極磷蝦酶解液中多肽主要由7種不同分子量的肽鏈組成,且25～100個(gè)AA組成的較長(zhǎng)肽鏈組分(41.73%～49.52%),除MKPEH外,由25個(gè)以內(nèi)AA組成的肽鏈含量超過(guò)50%,這種差異與4種酶解液的采用的外源蛋白酶的酶解特性及酶解程度有關(guān)。

表6 4種南極磷蝦酶解液中肽分子量的分布(%)Table 6 Molecular weight distribution of peptide of four Antarctic krill protein enzyme-hydrolysates(%)

由25個(gè)以下的AA組成的小分子肽鏈中,以15～25個(gè)AA組成的肽鏈(8.56%～14.19%)、7～13個(gè)AA組成的寡肽(12.25%～18.20%)及二肽與三肽(8.53%～9.09%)為主。南極磷蝦酶解液中肽譜組成特點(diǎn)與蚌肉酶解液中的肽分子量組成特點(diǎn)及有很大的區(qū)別,蚌肉酶解液中由6～10個(gè)AA組成的寡肽占14.96%,而相對(duì)分子質(zhì)量在334 Da以下的小肽及游離氨基酸占76.55%[16]。朱碧英等[22]用胃蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶解鳀魚(yú)蛋白獲得的水解產(chǎn)物中8肽以下的寡肽占50%左右,本研究中,AKPEH中8肽以下的寡肽占18.69%,高于其余3種酶解液(15.84%～15.92%),但顯著低于鳀魚(yú)水解產(chǎn)物中8肽以下的寡肽含量占比[22]。這種小肽含量的差異與采用的外源蛋白酶制劑種類、酶解底物蛋白種類以及水解程度有關(guān)。

研究證明,寡肽類(2～10個(gè)AA)在人體吸收代謝中具有重要的生理功能,小腸粘膜細(xì)胞能直接吸收2～10個(gè)AA的小肽,可以降低血壓,降低血液膽固醇值等。因此,本研究中,AKPEH的生物學(xué)功能性高于其余3種酶解液,可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為寡肽的功能食品原料。

3 結(jié)論

不同的外源蛋白酶制劑對(duì)南極磷蝦蛋白的水解程度不同,其中Alacalase 2.4 L的酶解效率最高。Leu、Arg、Val、Ala和Glu是酶解液中含量豐富的優(yōu)勢(shì)氨基酸種類。從∑TFAA、∑EAA、∑EAA/∑TFAA∑DAA、∑DAA/∑TFAA和F值的角度而言,酶解液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值從高到低依次為:AKPEH>PKPEH>FKPEH>MKPEH。南極磷蝦酶解液中鮮甜味氨基酸組分含量豐富,Glu對(duì)南極磷蝦酶解液鮮味的貢獻(xiàn)大于Asp,Ala和Gly對(duì)南極磷蝦酶解液的甜味貢獻(xiàn)高,Arg、His對(duì)南極磷蝦酶解液海鮮風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。南極磷蝦酶解液中肽的相對(duì)分子質(zhì)量呈不連續(xù)分布,AKPEH中8肽以下的寡肽占比高于其余3種酶解液。