呂婉靈，劉左軍，張小瑞，王玉賢

蘭州理工大學生命科學與工程學院,蘭州 730050

鈍裂銀蓮花(Anemoneobtusiloba)為毛茛科(Ranunculaceae)銀蓮花屬(Anemone L.)中的一種多年生草本植物，單花頂生，一般產生1～3個獨立花莖，花色有黃色、淺黃色和白色3種[1]。主要生長在海拔2900～4000 m的高山草地或鐵杉林下。分布區(qū)內年平均降水量534 mm，年平均溫度為1.6 ℃，從植物區(qū)系組成和水熱特征來看，屬于典型的高寒草甸[2]。目前，對鈍裂銀蓮花的研究主要集中在它的藥用價值、交配系統(tǒng)特征和花期資源分配[3]，以及在不同海拔條件下鈍裂銀蓮花的繁殖分配和繁育系統(tǒng)[4]等方面，對其花色素方面的研究幾乎未見報道。在寒冷的高原地區(qū)，鈍裂銀蓮花有其自身的適應機制。近年來高原地區(qū)環(huán)境變化顯著，鈍裂銀蓮花出現(xiàn)了明顯的白色花減少，以及淺黃色、黃色花花增多的現(xiàn)象，猜想這一現(xiàn)象可能與其對環(huán)境的適應性與生物進化有關。植物的花色素主要有類黃酮、類胡蘿卜素和生物堿三種[5]，類黃酮又分為黃酮、黃酮醇、黃烷酮和花色苷，黃酮和黃酮醇呈現(xiàn)黃色和無色，花色苷控制紅、藍和紫等顏色，可以分為三種：花葵素、飛燕草素和花青素，它們一般在同種花中單獨存在；類胡蘿卜素包括胡蘿卜素和葉黃素，呈現(xiàn)黃色、橙色、紅色和紫色；生物堿是甜菜堿、小檗堿、罌粟堿等的統(tǒng)稱，甜菜堿呈無色，罌粟堿呈黃色，小檗堿呈深橙色或黃色。而含有花色素的花都不含有生物堿[6]，薛德艷[7]等已成功提取鈍裂銀蓮花的類黃酮和類胡蘿卜素，所以本實驗重點分析這兩類色素。故本研究通過高效液相色譜、液質聯(lián)用分析黃色、淺黃色和白色的鈍裂銀蓮花花色素成分及含量，確定其導致花色不同的主要色素，進一步分析合成該色素的關鍵酶。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料為甘肅省合作(103°22′ E，35°18′ N)的白色、淺黃色、黃色鈍裂銀蓮花，于七月上旬采其盛花期花瓣，去除花蕊，沖洗干凈，80 ℃殺青30 min，然后 60 ℃烘干粉碎成末，裝于自封袋避光干燥保存。

1.2 紫外-可見分光光度計光譜分析

1.2.1 類黃酮光譜分析

分別稱取0.1 g各色干花瓣，加入5 mL甲醇一甲酸(98∶2，v/v)抽提溶劑，黑暗條件下浸提24 h，過濾，收集慮液，濾渣分次加人3 mL，2 mL抽提液，進行第2、3次的抽提，合并收集的慮液，定容至10 mL。用 UV-3000 型紫外-分光光度計在 200～700 nm內進行掃描，比色皿光徑1 cm。

1.2.2 類胡蘿卜素光譜分析

分別稱取0.1 g干花瓣，加入5 mL丙酮：乙醇(石油醚)1∶1的混合溶液，避光浸提24 h，過濾，再加入5 mL浸提，合并濾液，定容至10 mL。用 UV-3000 型紫外-分光光度計在 200～700 nm內進行掃描，比色皿光徑1 cm。

1.3 花色素定性定量分析

類黃酮樣品制備：取0.1 g干花瓣，加入5 mL甲醇一甲酸(98∶2，v/v)抽提溶劑，于4 ℃冰箱避光浸提24 h，取上清液用濾紙粗濾后,經(jīng)微孔濾膜(脂溶性0.45 μm)過濾。標準品：槲皮素、山奈酚、木犀草素、蘆丁購于上海源葉生物科技公司。

采用Waters 2685型高效液相色譜儀，Agilent 6460 LC/MS型液質聯(lián)用儀，Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)。色譜條件：流動相組成：A相0.1%磷酸一水溶液；B相乙腈溶液,洗脫程序如下：0 min，1%B；15 min，8%B；35 min，22%B；45 min，42%B；55 min，75%B；65 min，100%B。流速0.2 mL/min； 柱溫30 ℃，進樣量2 μL，紫外檢測波長：300 nm，PAD掃描波長范圍190～650 nm。

液質條件：色譜條件同上，質譜條件：離子化方式:電噴霧離子源(ESI)，正離子(PI)、負離子(NI)方式;電噴霧離子源參數(shù)：噴霧電壓：70 V～250 V；掃描區(qū)間:m/z100～1 000；氮氣流速9.0 L/min，溫度350 ℃。

2 結果與分析

2.1 紫外-可見分光光度計光譜分析

2.1.1 類黃酮光譜分析

由鈍裂銀蓮花類黃酮提取液的紫外-可見光光譜分析(圖1)可知，在268 nm和330 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，符合類黃酮的特征吸收峰。240～285 nm(峰帶Ⅱ)為主峰較明顯，300～350 nm(峰帶Ⅰ)較弱，A-環(huán)苯甲酰系統(tǒng)(峰帶Ⅱ)和B-環(huán)桂皮酰系統(tǒng)(峰帶Ⅰ)均含有[8]，A-環(huán)苯甲酰系統(tǒng)濃度較大。而隨著花色加深，類黃酮吸收峰逐漸增大，總含量隨花色深淺變化規(guī)律性變化(圖2)，白色較淺黃色最大吸光值分別下降64.03%(268 nm)和67.02%(330 nm),淺黃色較黃色最大吸光值分別下降35.44%(268 nm)和34.78%(330 nm)。

圖1 花色素紫外-可見分光光譜分析Fig.1 The UV-visible spectra of petal pigments in Anemone obtusiloba

2.1.2 類胡蘿卜素光譜分析

由鈍裂銀蓮花類胡蘿卜素提取液的紫外-可見光光譜分析(圖1)可知，在268 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，符合類胡蘿卜素的特征吸收峰,。隨花色加深，類胡蘿卜素吸收峰逐漸增大，總含量隨花色深淺變化規(guī)律性變化(圖2)，白色較淺黃色最大吸光值下降28.19%，淺黃色較黃色最大吸光值下降24.34%。

圖2 不同花色花色素的吸光度比較Fig.2 Comparison of petal pigments absorbance of different flower color

類黃酮和類胡蘿卜素的總吸光度均隨花色變淺而下降，但類黃酮的下降趨勢較類胡蘿卜素的更明顯(趨勢線斜率更大)，且總含量更高(圖2)，故類黃酮總含量變化更明顯，所以把類黃酮作為鈍裂銀蓮花花色變化的主要花色素定性定量分析 。

2.2 花色素定性定量分析

經(jīng)過對類黃酮提取物進行HPLC-PAD分析，鈍裂銀蓮花的不同花色在300 nm波長處均可檢測到7種化合物，且出峰時間基本一致，表明三種花色所含類黃酮種類一致，根據(jù)文獻[9]推測其花色的差異性不是由色素種類的不同引起的，而是由某種色素的含量變化導致的(圖3)。根據(jù)其不同花色同一峰的吸光度變化分析，吸光度的總變化趨勢均為隨花色變淺而減小，而峰1、2、5、6的化合物在相同花色的吸光度中也隨花色變淺而減小，推測其可能是主要色素。

為了進一步確定具體的色素種類，選取總含量較高的樣本進行HPLC-MS分析。故選用黃色花的類黃酮提取物進行定性分析。

圖3 黃色(A)、淺色(B)和白色(C)鈍裂銀蓮花類黃酮的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of flavonids from Anemone obtusiloba yellow(A),pale yellow(B) and white(C)

黃色花類黃酮樣品和4個標準品進行HPLC-MS分析，得到圖4、圖5的總離子流圖和圖6的樣品陽離子質譜圖，結合圖3，與相關參考文獻比較，得出表1的分析結果。

圖4 標準品槲皮素(1)、山奈酚(2)、木犀草素(3)和蘆丁(4)的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of standards lquercetin(1),kaempherol(2),luteolin(3) and quercetin-3-O-rutinoside(4)

圖5 黃色花類黃酮的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of flavonid from yellow flower

由圖5、圖6可知，峰7的 [M+H]+為m/z645.18，碎片離子m/z465為失去一分子葡萄糖所得，再脫去一分子葡萄糖得碎片m/z287，為木犀草素苷元，與文獻[10]報道相符合，推測其為木犀草素-3-7-O-葡萄糖苷。峰1、2、3、6的MS2中都有與槲皮素苷元相符的m/z303及其裂解的m/z274碎片，推測其為槲皮素的衍生物。6號峰的 [M]+為m/z625.15，含有碎片離子465和303，說明脫去兩分子六碳糖，與文獻[11,12]中槲皮素-3-O-蕓香糖苷碎片一致。峰3、2的 [M+H]+均為m/z465.1，脫去一分子六碳糖得m/z303，根據(jù)文獻[15,18]半乳糖苷極性較大，推測峰3為槲皮素-3-O-半乳糖苷，峰2為槲皮素-3-O-葡萄糖苷。峰1的 [M+H]+為m/z449.2，其碎片離子m/z303為脫去一分子鼠李糖，糖基離子為m/z146，與文獻[14,17]報道槲皮素-3-O-鼠李糖苷一致。5號峰[M+H]+為m/z611.2，碎片離子m/z287與山奈酚符合，推測其結構中含有山奈酚，碎片m/z445說明失去兩分子葡萄糖，與文獻[14]報道的山奈酚-3-O-槐糖苷一致。 峰4的 [M+3H]+為m/z483.1，含有楊梅黃素的特征離子m/z318，糖基離子為m/z146，與文獻[13,14]的楊梅黃素-3-O-鼠李糖相符合。

圖6 樣品的陽離子質譜圖Fig.6 Cationic mass spectrograms of sample

根據(jù)對各化合物的推測結果及圖3的吸光度變化，可以看出槲皮素的糖類衍生物含量占比較大，吸光度隨花色變化較明顯。

表1 鈍裂銀蓮花黃色花類黃酮HPLC-MS分析結果

3 結論

本研究通過紫外-可見光譜掃描法，HPLC-PAD和HPLC-MS的方法，分析鈍裂銀蓮花花色差異的主要色素及其關鍵酶。通過對類黃酮的紫外-可見光譜分析，根據(jù)譜帶Ⅱ和譜帶Ⅰ的位置推測，可能含黃酮及其醇類和異黃酮化合物，不含有二氫黃酮及其醇類、橙酮、查爾酮。HPLC-MS測定了類黃酮中的7種色素：木犀草素-3-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、山奈酚-3-O-槐糖苷、楊梅黃素-3-O-鼠李糖、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷，與紫外-可見光譜結果推測一致。由定性定量結果推測槲皮素的衍生物是導致鈍裂銀蓮花花色差異的主要色素，根據(jù)類黃酮代謝途徑[19]可以確定合成該色素的酶—類黃酮3′-羥化酶(flavonoid3′-hydroxylase F3′H)是影響槲皮素含量增加的關鍵酶。

鈍裂銀蓮花生長在環(huán)境惡劣的高寒地區(qū)，近年來環(huán)境變化顯著，其白色花逐漸減少，通過本實驗，確定了調控其花色深淺的關鍵酶，推測其花色適應環(huán)境的生物機制是通過調控黃酮醇合成酶來影響槲皮素的含量，進而影響槲皮素衍生物的含量，以達到改變花色深淺適應環(huán)境的目的。本實驗為進一步研究鈍裂銀蓮花的進化機制提供了有力的數(shù)據(jù)參考，對其花色的研究有比較有意義的價值。