潘 興，王黎青，楊遠(yuǎn)霞

0 引言

阿托伐他汀(Atorvastatin)自1999年在中國(guó)上市以來(lái)，是中國(guó)使用最廣泛的降脂藥物，約占心血管疾病二級(jí)預(yù)防總他汀用量的40%[1-2]。同時(shí)也是世界上使用最廣泛的他汀類藥物[3]。小檗堿(Berberine)是從黃連、黃柏、三顆針等植物中提取分離出的生物堿，也叫黃連素[4]，對(duì)細(xì)菌有微弱的抑菌作用，對(duì)痢疾桿菌、大腸桿菌引起的腸道感染有效。近年來(lái)的研究表明，小檗堿還有降脂作用[5]，其可能機(jī)制是通過(guò)抑制肝臟PCSK9的活性，使LDL-C受體表達(dá)增加，進(jìn)而減少血清中LDL-C水平；還可以通過(guò)激活A(yù)MP激酶和阻斷MAPK/ERK通路來(lái)降低三酰甘油水平[6]。由于小檗堿與他汀類不同的降血脂機(jī)制，小檗堿與阿托伐他汀聯(lián)合用藥的文獻(xiàn)報(bào)道較多[7-9]。同時(shí)，較多的文獻(xiàn)表明，小檗堿對(duì)體內(nèi)外細(xì)胞色素P450 3A(CYP3A)及P-糖蛋白(P-gp)均存在一定的影響，但因小檗堿給藥劑量不同、研究方法不同，其結(jié)論不同甚至相反[10-14]。阿托伐他汀作為CYP3A4與P-gp的共同底物[15]，與小檗堿聯(lián)合用藥時(shí)很有可能產(chǎn)生藥物相互作用。本研究探討小檗堿對(duì)阿托伐他汀鈣體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響，以指導(dǎo)臨床合理聯(lián)合用藥。

1 材料

1.1 藥品及試劑 阿托伐他汀鈣片(規(guī)格：20 mg/片，批號(hào)：T28958，輝瑞制藥有限公司)；鹽酸小檗堿片(規(guī)格：0.1 g/片，批號(hào)：2170440，東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司)；阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC>98%，購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：J1203AS)；乙腈(色譜級(jí)，BCR國(guó)際貿(mào)易公司)；甲醇(色譜級(jí)，BCR國(guó)際貿(mào)易公司)；氯化鈉(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20170401)；磷酸二氫鈉(分析純，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10102702)；磷酸(分析純，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10113901)；純凈水(實(shí)驗(yàn)室自制雙蒸水)。

1.2 儀器 高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司Agilent 1100系列)；安捷倫色譜柱 Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm)；Eppendorf Centrifuge 5415R-小型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)EPPENDORF公司)；XW-80A型漩渦振蕩混合器(上海第一醫(yī)學(xué)院儀器廠)；十萬(wàn)分之一電子分析天平(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；4 ℃冰箱(新飛電器集團(tuán)有限公司)；-20 ℃冰箱(美國(guó)Revco立式超低溫冰箱)；-80 ℃冰箱(美國(guó)NBS公司)。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重350～380 g，采購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(粵)2016-0041，編號(hào)：44002100015649。動(dòng)物飼養(yǎng)于無(wú)毒塑料盒中，每盒6只，每3天更換一次墊料，自由攝食和進(jìn)水，保持室內(nèi)溫度18～29 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，自然光照。正常飼養(yǎng)1周后使用。每次給藥前禁食12 h，給藥后禁食2 h，不禁水。

1.4 藥液配置 阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取阿托伐他汀鈣5.0 mg，至10 ml容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，得阿托伐他汀鈣儲(chǔ)備液500 μg/ml，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。飽和氯化鈉溶液：量取50 ml純凈水，加入氯化鈉直至飽和，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。灌胃給藥用阿托伐他汀鈣：取阿托伐他汀鈣片3片(60 mg)置于小燒杯中，加入20 ml蒸餾水，使用玻璃棒不停攪動(dòng)，使其均勻分散于水中，配置為3 mg/ml的阿托伐他汀鈣混懸液，使用前搖勻。灌胃給藥用鹽酸小檗堿：取鹽酸小檗堿片2片(200 mg)置于小燒杯中，加入10 ml蒸餾水，使用玻璃棒不停攪動(dòng)，使其均勻分散于水中，配制為20 mg/ml的鹽酸小檗堿混懸液，使用前搖勻。

2 方法

2.1 給藥方案 SD健康雄性大鼠共30只，隨機(jī)分為5組：A組單獨(dú)以阿托伐他汀鈣20 mg/kg的劑量灌胃；B組先予小檗堿30 mg/kg灌胃，5 min后阿托伐他汀鈣20 mg/kg相繼灌胃；C組先予小檗堿90 mg/kg灌胃，5 min后阿托伐他汀鈣20 mg/kg相繼灌胃；D組以小檗堿30 mg/kg連續(xù)灌胃6 d，在第7天灌胃給藥小檗堿5 min后，以20 mg/kg阿托伐他汀鈣灌胃給藥；E組以小檗堿90 mg/kg連續(xù)灌胃6 d，在第7天灌胃給藥小檗堿5 min后，以20 mg/kg阿托伐他汀鈣灌胃給藥。于阿托伐他汀鈣給藥前及給藥后0 min、10 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h眼眶采血約300 μl，收集于含肝素的1.5 ml離心管中，在3 600 r/min離心10 min，分離上清液，于-80 ℃留存，用于阿托伐他汀鈣含量檢測(cè)。

2.2 血漿樣品處理 精密量取100 μl血漿樣品，置于1.5 ml塑料離心管中，加入250 μl乙腈，50 μl 飽和氯化鈉溶液，漩渦混合1 min，12 000 r/min離心10 min，取200 μl上清液于1.5 ml離心管中，自然揮干，用30 μl乙腈復(fù)溶，旋渦混合30 s，取20 μl進(jìn)樣分析。

2.3 色譜條件 色譜柱：安捷倫Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：水(0.01 mol/L的磷酸二氫鈉，pH=3.3)-乙腈=30∶70；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 特異性考察 通過(guò)比較來(lái)自6只不同SD大鼠的空白血漿色譜圖，加入阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)品的空白血漿色譜圖以及血漿樣品的色譜圖來(lái)反映方法的特異性。檢測(cè)血漿中是否有代謝產(chǎn)物、雜質(zhì)、分解產(chǎn)物、基質(zhì)組分等干擾樣品的檢測(cè)。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量范圍 取阿托伐他汀鈣的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用乙腈逐級(jí)稀釋成濃度為20、16、8、4、2、1、0.6 μg/ml的阿托伐他汀鈣溶液。分別取上述各濃度的阿托伐他汀鈣溶液各10 μl，加入100 μl的空白血漿，分別配成阿托伐他汀鈣終濃度為2 000、1 600、800、400、200、100、60 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)樣品。按“2.2”項(xiàng)下方法處理樣品，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。以阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)作圖，采用最小二乘法計(jì)算線性回歸方程的斜率、截距、相關(guān)系數(shù)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線高低濃度范圍為定量范圍。定量下限的信噪比(S/N)不小于10。

2.4.3 準(zhǔn)確度和精密度考察 取阿托伐他汀鈣的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用乙腈分別稀釋成濃度為15、5、1.5 μg/ml的阿托伐他汀鈣溶液。分別取以上各濃度的阿托伐他汀鈣溶液各10 μl，加入100 μl的空白血漿，分別配成阿托伐他汀鈣終濃度為1 500、500、150 ng/ml的質(zhì)控樣品溶液。按“2.2”項(xiàng)下方法處理樣品，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件同一天內(nèi)進(jìn)樣5份，計(jì)算日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度；連續(xù)3 d內(nèi)每天進(jìn)樣1份，計(jì)算日間精密度和準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度表示為：測(cè)量值/真實(shí)值×100%，精密度表示為：測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。準(zhǔn)確度應(yīng)在85%～115%范圍內(nèi)，在定量下限附近應(yīng)在80%～120%范圍內(nèi)。精密度應(yīng)<15%，在定量下限附近應(yīng)<20%。

2.4.4 提取回收率考察 取阿托伐他汀鈣的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用乙腈分別稀釋成濃度為15、5、1.5 μg/ml的阿托伐他汀鈣溶液。分別取以上各濃度的阿托伐他汀鈣溶液各10 μl，加入100 μl的乙腈(代替空白血漿)，分別配成阿托伐他汀鈣終濃度為1 500、500、150 ng/ml的樣品溶液，每個(gè)濃度平行操作5份。按“2.2”項(xiàng)下方法處理樣品(加入150 μl乙腈)，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件同一天內(nèi)進(jìn)樣，將“2.4.3”項(xiàng)下操作測(cè)得的平均峰面積與此次檢測(cè)得到平均峰面積相比，即得提取回收率，其結(jié)果應(yīng)精密和可重現(xiàn)。

2.4.5 穩(wěn)定性考察 同“2.4.3”配置阿托伐他汀鈣終濃度為1 500、500、150 ng/ml的質(zhì)控樣品溶液。按“2.2”項(xiàng)下方法處理樣品，分別放置于室溫4 h和24 h，-80 ℃凍存3 d和7 d，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，每次檢測(cè)樣品平行操作3份，考察樣品處理后阿托伐他汀鈣的室溫和凍存穩(wěn)定性。

3 結(jié)果

3.1 特異性 大鼠的空白血漿色譜圖、加入阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)品的空白血漿色譜圖以及血漿樣品的色譜圖見(jiàn)圖1，從圖中可以看出，待測(cè)樣品峰形良好，與前后峰的分離度均>2(R>2)，符合檢測(cè)要求。

圖1 血漿樣品中阿托伐他汀鈣典型色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量范圍 以阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積為Y軸，濃度為X軸，采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到阿托伐他汀鈣的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.096 7 X+6.119 7，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 8，標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足生物樣品分析的要求。定量范圍為60～2 000 ng/ml，定量下限為60 ng/ml。

3.3 準(zhǔn)確度和精密度 血漿中阿托伐他汀鈣的3個(gè)質(zhì)控樣品(1 500、500、150 ng/ml)的日內(nèi)及日間準(zhǔn)確度和精密度見(jiàn)表1，結(jié)果表明，本方法的精密度和準(zhǔn)確度滿足要求。

表1 血漿中阿托伐他汀鈣的日內(nèi)和日間精密度及準(zhǔn)確度

3.4 提取回收率 阿托伐他汀鈣的3個(gè)質(zhì)控濃度(1 500、500、150 ng/ml)在血漿中的提取回收率在87.1%～95.0%之間，表明該方法對(duì)血漿中阿托伐他汀鈣具有良好的提取回收率。見(jiàn)表2。

表2 阿托伐他汀鈣在血漿樣品中的回收率

3.5 穩(wěn)定性 經(jīng)過(guò)測(cè)定，阿托伐他汀鈣的3個(gè)質(zhì)控濃度(1 500、500、150 ng/ml)樣品處理后在室溫下放置4 h和24 h，-80 ℃凍存3 d和7 d，所有樣品的穩(wěn)定性均在15%以內(nèi)。

3.6 藥動(dòng)學(xué)研究

3.6.1 大鼠單次灌胃小檗堿對(duì)阿托伐他汀鈣的藥代動(dòng)力學(xué)影響 大鼠單次灌胃阿托伐他汀鈣(A組)、單次小劑量小檗堿+阿托伐他汀鈣(B組)及單次大劑量小檗堿+阿托伐他汀鈣(C組)的血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2，各組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

圖2 大鼠單次灌胃小檗堿后體內(nèi)阿托伐他汀鈣藥時(shí)曲線

表3 大鼠單次灌胃小檗堿后阿托伐他汀鈣的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3.6.2 大鼠多次灌胃小檗堿對(duì)阿托伐他汀鈣的藥代動(dòng)力學(xué)影響 大鼠單次灌胃阿托伐他汀鈣(A組)、多次小劑量小檗堿+單次阿托伐他汀鈣(D組)及多次大劑量小檗堿+單次阿托伐他汀鈣(E組)的血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3，各組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。

表4 大鼠多次灌胃小檗堿后阿托伐他汀鈣的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖3 大鼠多次灌胃小檗堿后體內(nèi)阿托伐他汀鈣藥時(shí)曲線

4 討論

近年來(lái)，雙重藥物相互作用的概念，特別是涉及P-gp和CYP3A的概念，受到了廣泛關(guān)注[16-17]。腸壁細(xì)胞中CYP3A介導(dǎo)的藥物代謝和P-gp介導(dǎo)的藥物逆轉(zhuǎn)運(yùn)，限制了進(jìn)入全身循環(huán)的藥物總量，降低了藥物的口服生物利用度。而且腸道中P-gp和CYP3A4之間存在相互影響，P-gp通過(guò)延長(zhǎng)藥物與CYP3A4酶的接觸，降低藥物的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，從而增加藥物被腸壁CYP3A4代謝的機(jī)會(huì)，并影響藥物代謝的程度[18]。作為P-gp和CYP3A4的雙重底物，阿托伐他汀存在多樣性的藥物相互作用，據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已發(fā)現(xiàn)461個(gè)藥物會(huì)與阿托伐他汀發(fā)生藥物相互作用[15]。因此，在阿托伐他汀的聯(lián)合用藥過(guò)程中，應(yīng)特別注意藥物相互作用的影響，尤其與P-gp和/或CYP3A4的抑制劑/誘導(dǎo)劑合用時(shí)。

小檗堿通常被認(rèn)為是安全無(wú)毒的[19]，但在臨床應(yīng)用過(guò)程中有發(fā)生不良反應(yīng)致死的報(bào)道[20]，也發(fā)現(xiàn)了很多的藥物相互作用[21-22]。深入研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿所導(dǎo)致的藥物相互作用主要與其影響CYP450酶和P-gp的活性有關(guān)，但對(duì)于P-gp和CYP3A的影響，各項(xiàng)研究的結(jié)論有所不同[10-14]。自研究者發(fā)現(xiàn)了小檗堿的降脂作用后，在臨床將其與阿托伐他汀鈣聯(lián)合用藥的情況越來(lái)越多，因此，研究?jī)烧咧g的藥物相互作用是十分必要的。

在本研究中，我們將成人鹽酸小檗堿片的正常用量換算為大鼠的給藥劑量，研究小檗堿在正常劑量給藥下對(duì)阿托伐他汀鈣藥代動(dòng)力學(xué)的影響。研究結(jié)果表明，大鼠在單次及多次灌胃不同劑量的小檗堿后，阿托伐他汀鈣體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雖然多次給予大劑量小檗堿(90 mg/kg)后，阿托伐他汀鈣的Cmax及AUC均有不同程度的升高，但與單用阿托伐他汀鈣相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果與小檗堿對(duì)辛伐他汀的藥動(dòng)學(xué)影響類似[23]。本研究結(jié)果提示，臨床在聯(lián)合使用兩藥時(shí)，正常用量下小檗堿可能不會(huì)對(duì)阿托伐他汀鈣的藥動(dòng)學(xué)造成影響，但由于本研究是在大鼠體內(nèi)進(jìn)行的，與人體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)變化是否一致，仍需進(jìn)一步的研究。