戴單單 陳光輝 徐萍

[摘要] 目的 以阿霉素為模型藥物，制備新型的納米級(jí)醇質(zhì)體-丙二醇脂質(zhì)體（A-PL），并考察其體外抗腫瘤作用。 方法 制備A-PL，并通過透射電鏡、激光粒度分析儀、電位測(cè)定儀等觀察其微觀形態(tài)、測(cè)定粒徑和電位。以人肝癌細(xì)胞HepG-2為模型細(xì)胞株，采用MTT法考察A-PL體外細(xì)胞毒性，利用流式細(xì)胞儀和倒置熒光顯微鏡觀察HepG-2對(duì)A-PL的攝取，采用羅丹明試劑檢測(cè)細(xì)胞的P-糖蛋白（P-gp）功能。 結(jié)果 A-PL外觀圓整，分散性好，無聚集。平均粒徑為150 nm，Zeta電位為-5.78 mV，包封率為83.7%。A-PL的細(xì)胞毒性顯著高于阿霉素溶液;A-PL能增加細(xì)胞對(duì)藥物的攝取。此外，A-PL更容易進(jìn)入細(xì)胞，且與細(xì)胞核有較強(qiáng)的親和性。A-PL能抑制P-gp的過表達(dá)。 結(jié)論 本研究制備的A-PL克服了傳統(tǒng)脂質(zhì)體易聚集的缺點(diǎn)，具有穩(wěn)定、粒徑小的優(yōu)點(diǎn)，具有較好的抗腫瘤效果，作用機(jī)制則是主要依賴于A-PL的強(qiáng)內(nèi)吞作用及泊洛沙姆對(duì)藥物外排泵的抑制。

[關(guān)鍵詞] 丙二醇脂質(zhì)體;阿霉素;抗腫瘤;HepG-2

[中圖分類號(hào)] R943;R96? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）02（a）-0034-05

[Abstract] Objective To prepare a novel nano-alcoholic plastid-propylene glycol liposome， namely， adriamycin propanediol liposomes （A-PL） using adriamycin as a model drug and to investigate its anti-tumor effect in vitro. Methods A-PL glycol liposomes were prepared and their microscopic morphology， particle size and potential were observed by transmission electron microscopy， laser particle size analyzer and potentiometer. Human hepatoma cell line HepG-2 was used as the model cell line. The cytotoxicity of A-PL was examined by MTT assay. The uptake of A-PL by HepG-2 was observed by flow cytometry and inverted fluorescence microscopy. The function of P-glycoprotein （P-gp） was detected by rhodamine reagent. Results A-PL had a round appearance， good dispersion and no aggregation. The average particle size was 150 nm， the Zeta potential was -5.78 mV， and the encapsulation rate was 83.7%. The cytotoxicity of A-PL was significantly higher than that of adriamycin solution; A-PL could increase cell uptake of drugs. In addition， A-PL was easier to enter cells and had a strong affinity with the nucleus. A-PL could inhibit the overexpression of P-gp. Conclusion The A-PL prepared in this study overcomes the shortcomings of traditional liposome aggregation， has the advantages of stability and small particle size， and has good anti-tumor effect. The mechanism of action is mainly dependent on the strong endocytosis of A-PL and the inhibition of poloxamer on drug efflux pump.

[Key words] Propanediol liposomes; Adriamycin; Anti-tumor; HepG-2

化療作為癌癥治療的主要手段，存在兩大問題：一是化療藥物缺乏選擇性，二是多藥耐藥性[1-2]。靶向藥物制劑成為當(dāng)今抗腫瘤領(lǐng)域的研究主流[3-4]。高通透性和高滯留性[高滲透長(zhǎng)滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)）]是腫瘤靶向藥物設(shè)計(jì)的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。醇質(zhì)體是一種新型的柔性脂質(zhì)體，是在脂質(zhì)體的雙分子層中加入不同的柔軟劑，使脂質(zhì)體膜具有較強(qiáng)的柔順性和變形性，具有滲透性強(qiáng)的特點(diǎn)[6-7]。以丙二醇替代乙醇作為柔軟劑，既保持了醇質(zhì)體“可塑、柔韌、高滲透性”的優(yōu)點(diǎn)，又克服了易揮發(fā)的缺點(diǎn)，從而使藥物能夠利用EPR效應(yīng)被動(dòng)靶向聚集在腫瘤間質(zhì)[8-9]。泊洛沙姆是聚氧乙烯（PEO）-聚氧丙烯（PPO）-聚氧乙烯（PEO）的三嵌段共聚物。其中，PEO嵌段具有親水性，而PPO嵌段具有疏水性，可根據(jù)聚合物分子中PEO和PPO的比例區(qū)別不同型號(hào)的泊洛沙姆。Ⅱ類泊洛沙姆能夠最大程度地降低細(xì)胞膜微觀黏度和耗竭細(xì)胞內(nèi)腺苷三磷酸（ATP），抑制P-糖蛋白（P-gp）對(duì)阿霉素、紫杉醇等藥物的外排[10-13]。

本研究將泊洛沙姆逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的聚合物療法與納米級(jí)載藥丙二醇脂質(zhì)體技術(shù)相結(jié)合，制備多功能阿霉素丙二醇脂質(zhì)體（A-PL），提高腫瘤組織對(duì)化療藥物的吸收并降低其產(chǎn)生耐藥性，以期探索出一種提高腫瘤化療效率和安全性的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

透射電鏡（JEM-2100F，日本電子株式會(huì)社）、激光粒度分析儀（Mastersizer 2000，英國馬爾文儀器有限公司）、倒置熒光顯微鏡（Nikon eclipse TS100，日本Nikon）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（SpectraMax M2/M2e，美國Bio-Rad公司）、CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（M2300，美國Sheldon公司）、Zeta電位測(cè)定儀（馬爾文，北京東方安諾生化科技有限公司）。

1.2 試藥

人肝癌細(xì)胞HepG-2細(xì)胞由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供。6孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Costar原裝）、大豆卵磷脂E200（批號(hào)：139060，上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司）、泊洛沙姆188（批號(hào)：WPAK524B，BASF公司）、膽固醇（批號(hào)：CC25151602，上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司）、吐溫-80（批號(hào)：50116，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）、鹽酸阿霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS，批號(hào)：AC10260338，Hyclone）、MTT試劑盒（批號(hào)：01191818 0508，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、胎牛血清（批號(hào)：1428478，Gibco公司）、RPM1640培養(yǎng)液（批號(hào)：8115111，GIBCO公司）、0.25%胰蛋白酶消化液（批號(hào)：1869505，GIBCO公司）、二甲基亞砜（批號(hào)：1213C025，Solarbio公司）、1，2-丙二醇（批號(hào)：74697305，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）、檸檬酸鈉（批號(hào)：F20110114，上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司）、無水海藻糖（20160711，上海沃凱生物技術(shù)有限公司）、羅丹明123（Rh123）試劑（批號(hào)：R8004，sigma公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 阿霉素丙二醇脂質(zhì)體的制備? 精密稱取阿霉素（ADR）24 mg、大豆卵磷脂 40 mg、膽固醇20 mg、吐溫-80 2 mg、檸檬酸鈉5 mg、泊洛沙姆188 20 mg加入到2 mL丙二醇（丙二醇∶5%海藻糖=1∶5）中，60℃水浴溶解。將溶解后的丙二醇溶液緩慢加入到10 mL含有5%海藻糖溶液中，750 r/min旋轉(zhuǎn)30 min，再分別經(jīng)0.8、0.65、0.45、0.3、0.22 μm微孔濾膜過濾，即得A-PL，濃度為2 mg/mL[14]。

2.1.2 粒徑與Zata電位檢測(cè)? 取制備好的A-PL溶液，純水稀釋10倍后用激光粒度分析儀和Zeta電位分析儀分別測(cè)定脂質(zhì)體粒徑大小和Zeta電位。

2.1.3 包封率和載藥量檢測(cè)? 采用超速離心法分離未包封的游離藥物，HPLC高效液相法檢測(cè)藥物含量。色譜條件為：色譜柱KrusamA-PL C18（4.5 nm×250 nm，5 μm），保護(hù)柱：Agilent XDB-C18（4.5 mm×12.5 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸（30∶70），柱溫室溫，UV檢測(cè)吸收波長(zhǎng)為230 nm，流速為l mL/min。計(jì)算公式為：包封率=（藥物投料量-游離的藥物量）/藥物投料量×100%;載藥量=脂質(zhì)體中藥物量/（脂質(zhì)體中藥物+載體總量）×100%

2.1.4 細(xì)胞毒性檢測(cè)? 將HepG-2細(xì)胞種植在96孔板上（5×103個(gè)/孔）。孵育24 h后，每孔板分別加入空白乙醇脂質(zhì)體和空白丙二醇脂質(zhì)體，比較不同載體濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響。再取24孔板，分別加入不同濃度的A-PL和ADR溶液，并設(shè)立對(duì)照組（空白對(duì)照與陰性對(duì)照）。每組設(shè)5個(gè)濃度，分別為1、5、10、50、100 μg/mL。孵育12 h后，移去藥液并加入新鮮培養(yǎng)基及MTT溶液10 μL（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h，加入100 μL二甲基亞砜，振搖均勻，酶聯(lián)免疫法測(cè)定570 nm處的吸光度并計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.1.5 HepG-2對(duì)A-PL的攝取檢測(cè)? 將HepG-2細(xì)胞種接種在6孔板上，過夜。每孔板分別加入5個(gè)濃度的A-PL和ADR溶液，分別為1、5、10、50、100 μg/mL。孵育15 min后制備細(xì)胞懸液（0.5 mL/管）于流式管中檢測(cè)。

2.1.6 HepG-2對(duì)阿霉素丙二醇脂質(zhì)體的促攝取機(jī)制? 將HepG-2細(xì)胞種植在6孔板上過夜。每孔板加入50 μg/mL A-PL，分別孵育2、6、12、24 h后移去藥液并用冰PBS沖洗干凈，于倒置熒光顯微鏡觀察。

2.1.7 P-gp功能檢測(cè)? 選用環(huán)保菌素A（CsA）為陽性對(duì)照藥物，其主要作用機(jī)制為抑制P-gp功能。將HepG-2細(xì)胞接種于6孔板過夜，密度為1×106個(gè)/mL。實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)：組1（陰性對(duì)照組）：Rh123;組2：Rh123+ADR;組3：Rh123+A-PL;組4（陽性對(duì)照組）：Rh123+CsA。

2.1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 采用SAS 8.01統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用Newman-Keuls檢驗(yàn)，組內(nèi)比較用Student′s t-test，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 結(jié)果

2.2.1 阿霉素丙二醇脂質(zhì)體表征? A-PL微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)圓整，且具有明顯的磷脂雙分子層，部分醇脂體形成多層脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，粒徑在150 nm左右（圖1）。圖2所示測(cè)得的粒徑為164 nm，多分散指數(shù)（PDI）為0.145，粒徑對(duì)稱分布，單分散性較好，略大于透射電鏡結(jié)果，符合預(yù)期。Zata電位為-5.78 mV，粒徑對(duì)稱分布，彈性值>40。結(jié)果表明制備的A-PL形態(tài)好，粒徑小，具有良好的柔韌性和可塑性。

2.2.2 包封率和載藥量? 評(píng)價(jià)脂質(zhì)體物理性質(zhì)的重要指標(biāo)包括包封率和載藥量。20 000 r/min離心15 min后檢測(cè)制備的A-PL包封率為83.7%，符合2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。

2.2.3 細(xì)胞毒性? 細(xì)胞毒性大小影響著細(xì)胞生理活動(dòng)，脂質(zhì)體是造成細(xì)胞毒性的根本原因[15-16]。當(dāng)載體濃度<25%，細(xì)胞存活率均>90%，而細(xì)胞存活率隨乙醇脂質(zhì)體的載體濃度的增加而顯著下降;當(dāng)載體濃度>25%，丙二醇脂質(zhì)體組細(xì)胞存活率顯著降低，乙醇脂質(zhì)體組細(xì)胞存活率<10%（圖3）。提示丙二醇脂質(zhì)體較傳統(tǒng)的乙醇脂質(zhì)體具有更好的細(xì)胞安全性。載體濃度均<25%，可不考慮空白丙二醇脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的影響。

本研究還比較了A-PL與ADR溶液對(duì)細(xì)胞存活率的影響。隨ADR濃度增加，HepG-2細(xì)胞存活率與藥物劑量存在相關(guān)性;在同等濃度下，A-PL的細(xì)胞抑制率較高（圖4）。提示本研究制備的A-PL由于其特殊優(yōu)勢(shì)保持并提高了ADR的抗腫瘤活性。

2.2.4 阿霉素丙二醇脂質(zhì)體促細(xì)胞藥物攝取? 細(xì)胞內(nèi)藥物攝取呈劑量依賴性;隨著濃度增大，A-PL組與溶液組均向右位移;但無論在低濃度還是高濃度條件下，A-PL組的位移距離大于溶液組（圖5）。提示丙二醇脂質(zhì)體可增強(qiáng)HepG-2細(xì)胞對(duì)ADR的攝取，有利于藥物富集于靶細(xì)胞，并且發(fā)揮藥效。

隨著A-PL作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)隨之發(fā)生改變。作用2 h時(shí)HepG-2形態(tài)基本保持梭形;24 h后，細(xì)胞數(shù)量稀少，形態(tài)變圓形，并且可以看到細(xì)胞核中的熒光強(qiáng)度更大，提示A-PL具有良好的細(xì)胞毒性，粒徑小，制劑中加入的丙二醇增強(qiáng)了滲透性，使其與細(xì)胞核更具親和性。見圖6（封四）。

2.2.5 P-gp功能檢測(cè)? 細(xì)胞內(nèi)的Rh123累積量與劑量相關(guān)。與陰性對(duì)照組（組1）比較，ADR濃度<5 μg/mL時(shí)，ADR溶液處理（組2）的細(xì)胞內(nèi)Rh123累積量無明顯變化;A-PL處理（組3）的細(xì)胞內(nèi)Rh123累積量顯著較高（P < 0.05）。與陽性對(duì)照組（組4）比較，當(dāng)ADR濃度>50 μg/mL時(shí)，ADR處理（組2）和A-PL處理（組3）的細(xì)胞內(nèi)Rh123累積量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖7。這說明A-PL克服腫瘤耐藥性并不只是依賴內(nèi)吞作用，其還能抑制P-gp對(duì)ADR的外排。

3 討論

本研究基于已有丙二醇脂質(zhì)體制備方法基礎(chǔ)上，繼續(xù)優(yōu)化處方工藝，用丙二醇代替?zhèn)鹘y(tǒng)的乙醇等溶劑，并加入一定濃度泊洛沙姆，制備出新型的A-PL。外源性物質(zhì)除通過細(xì)胞膜上的微型孔道或者自由擴(kuò)散的方式進(jìn)入細(xì)胞漿外，還可以通過內(nèi)吞進(jìn)入[17-18]。丙二醇是一種良好的促滲劑，能增加脂質(zhì)體的彈性，使細(xì)胞脂質(zhì)膜由膠晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐壕B(tài)，增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性和細(xì)胞表面的孔道，有利于脂質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞[19]。熒光顯微鏡下觀察藥物攝取結(jié)果提示，ADR溶液主要以擴(kuò)散的方式進(jìn)入細(xì)胞，而本研究制備的A-PL則主要以內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞核。

本研究結(jié)果表明，基于丙二醇特性，使得A-PL更易進(jìn)入細(xì)胞，且與細(xì)胞有較強(qiáng)的親核性。泊洛沙姆逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的機(jī)制為：游離的PPO嵌段會(huì)插入生物膜的脂溶性區(qū)域，擾亂了生物膜的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變其流動(dòng)性[20-21]。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示含泊洛沙姆的脂質(zhì)體可以顯著抑制P-gp對(duì)ADR的外排。

綜上所述，A-PL不僅可以降低阿霉素的本身毒性，還可減少藥物用量，克服腫瘤耐藥性，提高抗腫瘤效果。其作用機(jī)制主要包括：①由于其具有高滲透性和滯留性，即高EPR效應(yīng)，其通過內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，具有較強(qiáng)的親核性。②通過抑制P-gp過表達(dá)而起到克服腫瘤耐藥性的作用。下一步研究中，我們將考察A-PL體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征及在組織中的分布特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究丙二醇脂質(zhì)體作為藥物載體體內(nèi)給藥奠定研究基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-04-16? 本文編輯：王? ?蕾）