崔龍 胡少銀 高進等

[摘要] 目的 優(yōu)選銀杏內(nèi)酯K的制備工藝。 方法 以銀杏內(nèi)酯B為原料，以銀杏內(nèi)酯B的收率為指標(biāo)，考察投料比（銀杏內(nèi)酯∶二乙氨基三氟化硫）、反應(yīng)溶劑用量比（銀杏內(nèi)酯∶二氯甲烷）、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)選銀杏內(nèi)酯K的最佳制備工藝條件，并采用波譜法鑒定其結(jié)構(gòu)，高效液相色譜法測定其含量，色譜條件為：ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：水-甲醇-異丙醇（60∶35∶5）;柱溫：30℃;流速：1.0 mL/min;檢測波長：220 nm。 結(jié)果 銀杏內(nèi)酯K的最佳制備工藝條件為投料比1∶4.5，反應(yīng)溶劑用量比1∶30，反應(yīng)時間20 min，反應(yīng)溫度4℃;所得目標(biāo)化合物經(jīng)Q-TOF-MS、1H-NMR、13C-NMR和二維核磁共振譜鑒定為銀杏內(nèi)酯K。 結(jié)論 該制備工藝條件溫和、制備周期短、操作簡便、收率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

[關(guān)鍵詞] 銀杏內(nèi)酯;銀杏內(nèi)酯K;氟化試劑;結(jié)構(gòu)鑒定

[中圖分類號] R283? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（a）-0043-04

[Abstract] Objective To optimize the preparation process of ginkgolide K. Methods Taking ginkgolide B as raw material， the yield of ginkgolide B as index， the ratio of feed （ginkgolide ∶ diethylaminotrifluoride）， the ratio of reaction solvent （ginkgolide ∶ dichloromethane）， reaction time and reaction temperature were investigated. The optimum preparation conditions of ginkgolide K were optimized by orthogonal design， and its structure was identified by spectroscopy and the content was detected by high performance liquid chromatography. The high performance liquid chromatography was performed on a ZORBAX SB-C18 chromatography column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） and with the detection wavelength at 220 nm. The mobile phase was water-acetonitrile-isopropyl alcohol （60∶35∶5）， flow rate was 1.0 mL/min， column temperature was 30℃. Results The optimum preparation conditions of ginkgolide K were as follows： the feed ratio was 1∶4.5， solvent ratio was 1∶30， reaction time was 20 min and reaction temperature was 4℃. The target compound was identified as ginkgolide K by Q-TOF-MS， 1H-NMR， 13C-NMR and two-dimensional NMR spectroscopy. Conclusion The preparation process is mild， the preparation cycle is short， the operation is simple， the yield is high， and it is suitable for industrial production.

[Key words] Ginkgolide; Ginkgolide K; Fluoride reagent; Structural identification

銀杏內(nèi)酯K是一種強的天然血小板活化因子拮抗劑，能有效改善腦缺血再灌注造成的小鼠神經(jīng)細胞的損傷，減少組織壞死，對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠具有保護作用[1-5]，它可以抑制H2O2、谷氨酸等誘導(dǎo)的細胞調(diào)亡，減輕受損細胞的氧化應(yīng)激水平[6-7]，并有效改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細胞凋亡，治療心血管疾病[8]。銀杏內(nèi)酯K 對血小板活化因子介導(dǎo)的中性粒白細胞葡萄糖酸苷酶釋放的抑制作用優(yōu)于銀杏內(nèi)酯B，對腦缺血再灌注急性期神經(jīng)損傷中的保護作用優(yōu)于銀杏內(nèi)酯B以及白果內(nèi)酯[9-12]。然而，銀杏葉中銀杏內(nèi)酯K的含量極低，且分離困難，嚴重制約了該化合物的應(yīng)用研究。

目前，尚無銀杏內(nèi)酯K制備的研究報道。Bolshakov等[13]報道了銀杏內(nèi)酯A、10-芐基-銀杏內(nèi)酯C在二乙氨基三氟化硫存在的條件下，高選擇性地作用于其三級醇羥基，分別生成了銀杏內(nèi)酯L和3，14-脫水-10-芐基-銀杏內(nèi)酯C。根據(jù)上述報道可知，二乙氨基三氟化硫?qū)︺y杏內(nèi)酯類化合物的三級醇羥基有較好的選擇性，對其中的二級醇羥基也有一定的作用。本研究以銀杏內(nèi)酯B為原料，以投料比（銀杏內(nèi)酯∶二乙氨基三氟化硫）、反應(yīng)溶劑用量比（銀杏內(nèi)酯∶二氯甲烷）、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度考察因素，采用正交試驗設(shè)計對銀杏內(nèi)酯K的制備工藝進行優(yōu)選，以期為其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用研究提供幫助。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MS205DU電子天平（梅特勒-托利多，0.01/0.1 mg）、Bruker AM-400核磁共振儀（瑞士Bruker公司）、Q-TOF-LC-MS聯(lián)用儀、Agilent 1260型高效液相色譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司]、N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀-循環(huán)冷卻裝置[埃朗科技貿(mào)易（上海）有限公司]、SH05-3G恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦有限公司）、BCD-218冰箱（西門子）、LGJ-12型冷凍干燥機（北京松源華興有限公司）。

1.2 試藥

銀杏內(nèi)酯B（批號：160501，純度：91.2%，購自臨沂愛康藥業(yè)有限公司）、銀杏內(nèi)酯K（批號：111936-201502，純度：94.7%，購自中國食品藥品檢定研究院）。

二乙胺基三氟化硫[購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]，甲醇、異丙醇、二甲基亞砜為色譜純，二氯甲烷、乙酸乙酯、95%乙醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 銀杏內(nèi)酯K制備

取0.43 g銀杏內(nèi)酯B（0.1 mol），加入裝有30 mL二氯甲烷的三口反應(yīng)瓶中，置于冰水浴上攪拌溶解，同時緩慢加入60 μL（0.45 mol）二乙氨基三氟化硫，冰水浴中4℃保溫反應(yīng)20 min后，加入冰水淬滅反應(yīng)，充分攪拌反應(yīng)液，分離水相。用乙酸乙酯萃取水相，乙酸乙酯相用無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮蒸出溶劑即得銀杏內(nèi)酯K粗品。銀杏內(nèi)酯K粗品用乙酸乙酯和乙醇的混合溶劑結(jié)晶48 h（結(jié)晶48 h后結(jié)晶物不再增加），得到白色結(jié)晶片狀固體，減壓干燥12 h，即得目標(biāo)產(chǎn)物，稱重，計算收率?；瘜W(xué)反應(yīng)式見圖1。

2.2 銀杏內(nèi)酯K含量測定

2.2.1 對照品溶液制備? 取銀杏內(nèi)酯K對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為0.05 mg/mL的對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備? 稱取銀杏內(nèi)酯K樣品約5 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗? 采用HPLC法測定銀杏內(nèi)酯K的含量，參考相關(guān)研究[14-16]的方法并進行了優(yōu)化。色譜條件為：ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：水-甲醇-異丙醇（60∶35∶5）;柱溫：30℃;流速：1.0 mL/min;檢測波長：220 nm。理論塔板數(shù)以銀杏內(nèi)酯K計不低于10 000。

2.2.4 銀杏內(nèi)酯K測定方法? 照高效液相色譜法（《中國藥典》2015年版通則0512）測定。精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測定，以外標(biāo)兩點法計算銀杏內(nèi)酯K的含量，即得。

2.3 正交實驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，取銀杏內(nèi)酯B原料9份，每份0.43 g，以銀杏內(nèi)酯K的收率為評價指標(biāo)，考察投料比（銀杏內(nèi)酯∶二乙氨基三氟化硫）、反應(yīng)溶劑用量比（銀杏內(nèi)酯∶二氯甲烷）、反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度，采用四因素三水平的L9（34）正交表優(yōu)選銀杏內(nèi)酯K的制備工藝。因素水平見表1，正交表及試驗結(jié)果見表2。

四個因素對銀杏內(nèi)酯K的收率影響大小為：投料比>反應(yīng)時間>溶劑用量比>反應(yīng)溫度。最佳的工藝條件為投料比為1∶4.5，反應(yīng)溶劑用量比為1∶30，反應(yīng)時間為20 min，反應(yīng)溫度為4℃。見表2。方差分析表明，各因素試驗水平對銀杏內(nèi)酯K的收率均無顯著性影響。見表3。

2.4 驗證試驗

取銀杏內(nèi)酯B原料3份，每份約10 g，根據(jù)正交試驗設(shè)計優(yōu)選的最佳制備工藝條件進行3批驗證試驗。3批驗證試驗表明，銀杏內(nèi)酯K的收率分別為75.10%、75.74%、75.29%，均值為75.38%，RSD為0.44%，表明該工藝穩(wěn)定性良好。

2.5 結(jié)構(gòu)確證

通過化學(xué)合成的方法制備、分離純化得到的化合物為白色片狀結(jié)晶（乙醇-乙酸乙酯），進一步用質(zhì)譜及核磁共振譜分析其結(jié)構(gòu)。TOF-MS-ES-（m/z）405.1167（計算值為405.1186）。見圖2。1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)（表4～5）與Weinges等[17]的研究報道一致。結(jié)合上述質(zhì)譜、1H-NMR、13C-NMR以及二維核磁譜H-H COSY、HSQC、HMBC和NOESY的數(shù)據(jù)，確定該化合物為銀杏內(nèi)酯K，分子式為C20H22O9。其結(jié)構(gòu)見圖3。

3 討論

近年來，銀杏內(nèi)酯K在腦血管疾病中的作用機制研究取得了新的進展，其作用機制可能與銀杏內(nèi)酯A、B等化合物不同[18]，但還需要進一步研究。與銀杏內(nèi)酯K制備有關(guān)的文獻報道較少。在某些條件下，銀杏內(nèi)酯B的3-OH被活化，產(chǎn)生其衍生物銀杏內(nèi)酯K，但其轉(zhuǎn)化率非常有限[19]。Zekri等[20]研究表明，銀杏內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與其溶解介質(zhì)的pH值密切相關(guān)，當(dāng)pH=7時，其內(nèi)酯環(huán)開始開環(huán)，在堿性條件下不穩(wěn)定易開環(huán)，易造成副產(chǎn)物的增多。因此，在堿性條件下制備銀杏內(nèi)酯K的方法產(chǎn)率低且副產(chǎn)物較多，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

本研究選用最常見的氟化試劑二乙氨基三氟化硫，其對銀杏內(nèi)酯類化合物的三級醇羥基有較好的選擇性，且適當(dāng)過量的二乙氨基三氟化硫更有利于反應(yīng)。另外，這可能對其二級醇羥基也有一定的作用，但未分離到氟代的產(chǎn)物，與Bolshakov等[13]的研究報道基本一致。本研究采用正交試驗設(shè)計得到銀杏內(nèi)酯K的最佳制備工藝條件，即投料比為1∶4.5，溶劑用量比為1∶30，反應(yīng)時間20 min和反應(yīng)溫度4℃。在此工藝條件下，制備、純化銀杏內(nèi)酯K的收率大于75%。該制備工藝操作簡單、周期短、穩(wěn)定性好，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

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（收稿日期：2018-02-28? 本文編輯：王? ?蕾）