李源 夏中元

[摘要] 目的 探討抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）對(duì)高脂高糖聯(lián)合缺氧/復(fù)氧所致H9C2心肌細(xì)胞損傷及其對(duì)時(shí)鐘基因BMAL1表達(dá)的影響。 方法 將培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞分為對(duì)照組（N組）、高脂高糖聯(lián)合缺氧/復(fù)氧組（HFHG+H/R組）、高脂高糖聯(lián)合缺氧/復(fù)氧+NAC組（HFHG+H/R+NAC組）。CCK-8法檢測細(xì)胞活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，DCFH-DA染色觀察活性氧（ROS）水平，JC-1染色檢測細(xì)胞線粒體膜電位（MMP），Western blot測定BMAL1表達(dá)水平。 結(jié)果 與N組比較，HFHG+H/R組細(xì)胞活性明顯降低（P < 0.01），凋亡率與ROS水平明顯升高（P < 0.01），而BMAL1表達(dá)水平顯著降低（P < 0.01）。經(jīng)NAC處理后，HFHG+H/R+NAC組以上變化均顯著減小，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。HFHG+H/R組MMP較N組明顯降低;經(jīng)NAC處理后，HFHG+H/R+NAC組MMP明顯升高。 結(jié)論 NAC可能通過抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，并促進(jìn)時(shí)鐘基因BMAL1表達(dá)，從而減小高脂高糖與缺氧/復(fù)氧所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷。

[關(guān)鍵詞] N-乙酰半胱氨酸;BMAL1;氧化應(yīng)激;心肌細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] R587.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）02（c）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of antioxidant N-acetylcysteine （NAC） on H9C2 cardiomyocyte injury induced by high-fat and high-glucose combined with hypoxia/reoxygenation and its effect on the expression of clock gene BMAL1. Methods H9C2 cells were divided into control group （N group）， high-fat and high-glucose combined with hypoxia/reoxygenation group （HFHG+H/R group）， high-fat and high-glucose combined with hypoxia/reoxygenation +NAC group （HFHG+H/R+NAC group）. Cell viability was detected by CCK-8 method， cell apoptosis was detected by the flow cytometry， reactive oxygen species （ROS） level was observed by DCFH-DA staining， mitochondrial membrane potential （MMP） was detected by JC-1 staining， and the expression level of BMAL1 was determined by Western blot. Results Compared with N group， the cell viability of HFHG+H/R group was significantly lower （P < 0.01）， the apoptosis rate and ROS level were significantly increased （P < 0.01）， while the expression level of BMAL1 was significantly reduced （P < 0.01）. After NAC treatment， the changes of indicators above in the HFHG+H/R+NAC group were significantly reduced， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. MMP in the HFHG+H/R group was significantly lower than that in the N group. After NAC treatment， MMP of HFHG+H/R+NAC group was significantly increased. Conclusion NAC may reduce the oxidative stress level of cardiomyocytes and promote the expression level of clock gene BMAL1， thereby reducing cardiomyocyte damage induced by high-fat and high-glucose combined with hypoxia/reoxygenation.

[Key words] N-acetylcysteine; BMAL1; Oxidative stress; Cardiomyocyte

缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD）是2型糖尿?。═2DM）患者的主要死亡原因。改善缺血心肌的血液灌注是治療IHD最根本的措施，但缺血再灌注會(huì)導(dǎo)致缺血心肌損傷的進(jìn)一步加重[1]。研究表明，氧化應(yīng)激是糖尿病并發(fā)癥IHD缺血再灌注損傷的主要機(jī)制[2-3]。近年研究發(fā)現(xiàn)節(jié)律紊亂是增加糖尿病、肥胖和代謝綜合征風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)重要因素，并可能是導(dǎo)致心血管事件發(fā)生的重要機(jī)制[4]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胰島素分泌具有特殊節(jié)律，并與時(shí)鐘基因BMAL1密切相關(guān)[5]。不僅如此，BMAL1亦有調(diào)控氧化應(yīng)激的作用[6]。因此，本研究旨在明確體外條件下抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）對(duì)高脂高糖復(fù)合缺氧/復(fù)氧所致H9C2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并探索其對(duì)時(shí)鐘基因BMAL1表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

H9C2大鼠胚胎心肌細(xì)胞購自武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心。活性氧（ROS）試劑盒（批號(hào)：170824）、JC-1試劑盒（批號(hào)：170904）、Cell Counting Kit-8（CCK-8）（批號(hào)：170716）均購自中國碧云天公司;PE/7-AAD試劑盒（批號(hào)：7026588）購自美國BD公司;BMAL1抗體購自美國Novus公司;β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology（CST）公司;羊抗兔二抗購自美國Li-cor公司;NAC試劑購自美國sigma公司;熒光顯微鏡來自奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 H9C2大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)? 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)前去血清培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化，然后對(duì)心肌細(xì)胞分別進(jìn)行如下處理：對(duì)照組（N組）培養(yǎng)基中含5.5 mmol/L葡萄糖、20 mmol/L甘露醇，高脂高糖復(fù)合缺氧/復(fù)氧組（HFHG+H/R組）培養(yǎng)基中含25 mmol/L葡萄糖、500 μmol/L軟脂酸，高脂高糖復(fù)合缺氧/復(fù)氧+NAC組（HFHG+H/R+NAC組）培養(yǎng)基中含25 mmol/L葡萄糖、500 μmol/L軟脂酸、400 μmol/L NAC。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活性? 取對(duì)數(shù)生長期的H9C2細(xì)胞，計(jì)數(shù)后種植于96孔板，每孔種植細(xì)胞數(shù)為10 000個(gè)，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24～72 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液于酶標(biāo)儀檢測。置于酶標(biāo)儀中在450 nm處檢測吸光度值（OD值），以“培養(yǎng)液空白對(duì)照孔”調(diào)零。細(xì)胞存活率（%）=處理組A/對(duì)照組A×100%。

1.2.3 JC-1法檢測線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）? 處理各組細(xì)胞后，用PBS洗滌1次，加入DMEM 1 mL，再加入1 mL JC-1染色工作液并混勻。在37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育同時(shí)，按1∶4比例混勻染色緩沖液（5×）和蒸餾水，配制成染色緩沖液（1×），置于冰上。孵育完成后，用配好的JC-1染色緩沖液（1×）將細(xì)胞洗2次。再加入2 mL DMEM后置于熒光顯微鏡下，觀察并記錄各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.2.4 Western blot檢測BMAL1表達(dá)水平? 收集處理各組細(xì)胞，經(jīng)RIPA裂解，超聲破碎，12 000 g 4℃離心，取上清。用BCA法測定蛋白樣品濃度，用RIPA校正。按體積比4∶1加入5×上樣緩沖液，100℃金屬浴5～10 min。按50 μg/泳道行SDS-PAGE凝膠電泳，于100 V恒壓下電泳90 min，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂牛奶封閉1 h，使用兔抗鼠抗體抗（1∶1000）4℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3次，熒光二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次，最后，用Odyssey熒光紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜分析并讀取各組灰度值。

1.2.5 DCFH-DA染色檢測ROS水平? 去除培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，更換含有DCFH-DA（終濃度為10 μmol/L）的DMEM培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。用無血清DMEM洗滌3次，于熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡? 收集處理后各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)1×107個(gè)細(xì)胞，離心去上清，PBS洗滌2次，離心去上清，加入100 μL結(jié)合緩沖液重懸，加入5 μL 7-AAD、5 μL PE溶液混勻，避光孵育20～30 min，再加入400 μL緩沖液混勻，流式細(xì)胞儀分析凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。本研究數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間點(diǎn)三組細(xì)胞活力比較

在培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，三組細(xì)胞活力總體比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;與N組比較，HFHG+H/R組細(xì)胞活性明顯下降（P < 0.01），加入NAC后細(xì)胞活力較HFHG+H/R組明顯提高（P < 0.01）。

2.2 三組細(xì)胞ROS水平比較

三組ROS水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 383.9，P < 0.01）;與N組（0.019±0.003）比較，HFHG+H/R組ROS（0.099±0.003）生成明顯增多（P < 0.01）;與HFHG+H/R組比較，HFHG+H/R+NAC組ROS（0.016±0.002）生成明顯減少（P < 0.01）。

2.3 三組細(xì)胞MMP比較

與N組比較，HFHG+H/R組MMP明顯降低;與HFHG+H/R組比較，HFHG+H/R+NAC組MMP明顯升高。

2.4 三組細(xì)胞凋亡率比較

三組細(xì)胞凋亡率比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 1746.0，P < 0.01）。與N組[（0.912±0.015）%]比較，HFHG+H/R組細(xì)胞凋亡率[（16.601±0.304）%]明顯升高（P < 0.01）;與HFHG+H/R組比較，HFHG+H/R+NAC組細(xì)胞凋亡率[（8.055±0.115）%]明顯降低（P < 0.01）。

2.5 三組細(xì)胞BMAL1蛋白表達(dá)水平比較

三組BMAL1蛋白表達(dá)水平比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 1867.0，P < 0.01）。與N組比較，HFHG+H/R組BMAL1表達(dá)明顯降低（P < 0.01）;與HFHG+H/R組比較，HFHG+H/R+NAC組BMAL1表達(dá)明顯升高（P < 0.01）。

3 討論

T2DM可通過持續(xù)性高血糖癥、高脂血癥、增加的ROS產(chǎn)生和炎癥通路下游轉(zhuǎn)錄因子，影響心肌糖/脂代謝、肌細(xì)胞生長、內(nèi)皮功能和心肌結(jié)構(gòu)的改變等誘導(dǎo)糖尿病心肌病[7]。而心肌組織中過度產(chǎn)生的ROS被認(rèn)為是糖尿病心肌病發(fā)展的最主要機(jī)制之一[8]。心肌在高糖高脂的外環(huán)境下，氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過載增加，可能是ROS產(chǎn)生的主要原因[9]。心肌細(xì)胞中ROS主要來源于NADPH和線粒體[10]。NAC可直接透過細(xì)胞膜及線粒體膜而直接清除ROS。

T2DM主要發(fā)病機(jī)制是胰島素抵抗，血脂代謝異?？杉又匾葝u素抵抗[11]。長期高脂高糖刺激亦可對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生損傷[12]。研究表示高脂高糖可造成乳鼠心肌細(xì)胞損傷[13]。本研究選擇H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72 h后進(jìn)行處理，再使用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力。各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中，HFHG+H/R組細(xì)胞活性與N組比較均出現(xiàn)明顯下降（P < 0.01），加入NAC后細(xì)胞活力均有明顯提高（P < 0.01），提示NAC可改善高脂高糖與缺氧/復(fù)氧加重的H9C2心肌細(xì)胞損傷。因?yàn)榕囵B(yǎng)24 h各組即可出現(xiàn)明顯差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，培養(yǎng)時(shí)間我們選擇24 h。

隨后，我們通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的ROS水平，與HFHG+H/R組比較，加入NAC后細(xì)胞ROS表達(dá)明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），提示NAC可減輕高脂高糖復(fù)合缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的ROS上升。

細(xì)胞損傷的最終表現(xiàn)就是細(xì)胞死亡，細(xì)胞死亡主要方式為壞死和凋亡[14]。MMP水平下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件[15]。JC-1熒光探針可檢測MMP水平。熒光顯微鏡觀察顯示，與N組比較，HFHG+H/R組紅色熒光明顯降低，加入NAC后，HFHG+H/R+NAC組紅色熒光明顯升高;流式細(xì)胞儀凋亡檢測結(jié)果與JC-1結(jié)果一致。提示高脂高糖復(fù)合缺氧/復(fù)氧可使H9C2心肌細(xì)胞凋亡加重，而NAC可減輕這一促進(jìn)作用。

研究表明核心時(shí)鐘基因BMAL1靶向缺失的小鼠（BMAL1-/-）顯示了不同器官的高水平的ROS[16]，還有研究表明，BMAL1缺失的小鼠ROS產(chǎn)生增加[17]，表明BMAL1在氧化還原穩(wěn)態(tài)中產(chǎn)生了作用。

晝夜節(jié)律紊亂可影響糖脂代謝，亦可促進(jìn)T2DM的發(fā)展[18-19]。BMAL1的表達(dá)與胰島生長、存活和增殖調(diào)節(jié)有關(guān)，通過藥物影響細(xì)胞中BMAL1的表達(dá)可改善胰島損傷[20]。本研究中，與HFHG+H/R組比較，HFHG+H/R+NAC組BMAL1的表達(dá)明顯升高（P < 0.01），提示NAC可影響高脂高糖復(fù)合缺氧/復(fù)氧處理的H9C2心肌細(xì)胞BMAL1的表達(dá)水平。

綜上所述，NAC可能通過抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，并促進(jìn)時(shí)鐘基因BMAL1表達(dá)水平，從而減小高脂高糖復(fù)合缺氧/復(fù)氧所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷。

本研究主要在細(xì)胞上進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)和論證，在動(dòng)物模型上尚未驗(yàn)證，具有一定局限性，后期將進(jìn)一步對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。本研究通過使用缺氧/復(fù)氧模擬缺血再灌注并用ROS抑制劑NAC作用于高脂高糖培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞，通過對(duì)BMAL1表達(dá)、細(xì)胞活性、MMP、凋亡率和ROS水平的檢測，得出結(jié)論：NAC可能通過抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，并促進(jìn)時(shí)鐘基因BMAL1表達(dá)水平，從而減小高脂高糖復(fù)合缺氧/復(fù)氧所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷。

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（收稿日期：2018-08-14? 本文編輯：羅喬荔）