狄雯雯，吳曉航，李艷，戴肖南

（齊魯工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353）

Ⅰ型膠原作為具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的棒狀生物大分子，在生物學(xué)上具有一些優(yōu)良的特征，如低免疫原性、生物可降解性及止血性等[1-2]，目前已成為生物工程材料及組織工程基底材料的首選[3-4]。

在膠原的應(yīng)用過(guò)程中，膠原分子的變性及分散體系的流變性一直是人們關(guān)心的問題。本課題組曾研究了鹽酸胍（GuHCl）對(duì)Ⅰ型膠原的變性作用，以及對(duì)膠原分散體系流變性的影響，發(fā)現(xiàn)在不同條件下，鹽酸胍/Ⅰ型膠原分散體系可分別呈現(xiàn)出正觸變性、負(fù)觸變性及復(fù)合觸變性特征[5]。為了系統(tǒng)研究膠原分散體系在變性后的流變行為，本文進(jìn)一步研究了鹽酸胍/Ⅰ型膠原分散體系在不同pH條件下的觸變性，所得結(jié)果將有助于加深對(duì)觸變性產(chǎn)生機(jī)理的認(rèn)識(shí)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑及儀器

胃蛋白酶（活性1∶3 000）及彩虹245廣譜蛋白馬克（分子量范圍11～245 kD），由上海索萊寶生物科技有限公司提供；GuHCl，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。DHR-2型旋轉(zhuǎn)流變儀（美國(guó)TA公司）、LGJ-10D型冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)）、GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭）、JY-SCZ2型雙垂直電泳槽（北京君毅）。

1.2 膠原的提取

采用胃蛋白酶降解法提?、裥湍z原蛋白[5]。

1.3 GuHCl/膠原體系的配制

用Tris-HCl緩沖溶液（c=0.05 mol/L）配制膠原分散體系，膠原濃度為3 mg/mL；分別調(diào)節(jié)體系的pH值至酸性（pH=5.0）、中性（pH=7.2）及堿性（pH=9.0，11.0）條件；然后加入鹽酸胍，使鹽酸胍在分散體系中的濃度分別為0.25 mol/L、1.0 mol/L及2.0 mol/L；加入鹽酸胍12 h后開始觸變性測(cè)定實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)溫度固定為（25.0±0.1）℃。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

體系觸變性的測(cè)定采用DHR旋轉(zhuǎn)流變儀錐板測(cè)量系統(tǒng)（直徑40 mm，夾角2°）。先將所有樣品放置在測(cè)量板上，靜置10 min，然后再進(jìn)行觸變性的測(cè)定實(shí)驗(yàn)。首先，采用高速預(yù)剪切(D＝1 000 s-1，t=60 s)破壞樣品體系內(nèi)部原有的結(jié)構(gòu)；剪切停止后，采用小幅振蕩剪切法，在線性黏彈區(qū)（f=1 Hz，τ=1 Pa）考察體系結(jié)構(gòu)的恢復(fù)過(guò)程：若隨時(shí)間的延長(zhǎng)，體系復(fù)合黏度|η*|的數(shù)值升高，說(shuō)明體系為正觸變性體系；若|η*|的數(shù)值降低，則為負(fù)觸變性體系；若|η*|先升高，達(dá)到最大值后又開始降低，則為復(fù)合觸變性體系。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與機(jī)理探討

2.1 膠原的結(jié)構(gòu)表征

提取的豬皮膠原凝膠電泳圖譜如圖1所示。從圖譜中可以看出，膠原分子主要由二條α鏈（α1,α2）和一條β鏈組成。二條α鏈的分子量皆為100～135 kDa；并且α1鏈譜帶的寬度約為α2鏈的2倍，顏色也較α2鏈深，表明膠原分子中α1鏈的含量約為α2鏈的2倍。以上凝膠電泳結(jié)果說(shuō)明，所制備的膠原為典型的Ⅰ型未變性膠原。圖1結(jié)果還顯示，在膠原分子中還存在β鏈（二聚體）和γ鏈（三聚體），說(shuō)明在膠原分子內(nèi)和分子間還存在多種交聯(lián)結(jié)構(gòu)。此外，在體系中加入β-巰基乙醇（β-ME）后，膠原的凝膠電泳譜帶沒有發(fā)生改變，與原來(lái)的一致，說(shuō)明膠原中不含有二硫鍵。

圖1 膠原凝膠電泳圖

所提取豬皮膠原的紅外光譜如圖2所示，含有5個(gè)特征吸收峰，分別是酰胺A、酰胺B、酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ及酰胺Ⅲ，分別對(duì)應(yīng)于3 315、3 073、1 641、1 552及1 244 cm-1。以上結(jié)果與文獻(xiàn)一致[6]，進(jìn)一步說(shuō)明所提取的豬皮膠原為Ⅰ型膠原。

圖2 膠原蛋白紅外光譜圖

2.2 pH對(duì)膠原分散體系觸變性的影響

不同pH條件下，純膠原分散體系的觸變性測(cè)定結(jié)果如圖3所示。圖3顯示，在體系結(jié)構(gòu)的恢復(fù)過(guò)程中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，體系的|η*|先緩慢升高，當(dāng)超過(guò)500 s（pH=5.0或pH=7.2）或超過(guò)1 000 s（pH=9.0或pH=11.0）后，復(fù)合黏度|η*|隨t迅速上升，最終曲線趨于平緩，均表現(xiàn)為正觸變性。

由文獻(xiàn)[7]可知，通過(guò)自組裝，膠原分子之間可以有序地排列成網(wǎng)狀、層狀或錯(cuò)列的纖維結(jié)構(gòu)，這種纖維的直徑和長(zhǎng)短都會(huì)隨著外界因素的改變而改變。在高速預(yù)剪切過(guò)程中，較高的外加剪切力可以部分破壞這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為體系的黏度降低。在結(jié)構(gòu)的恢復(fù)過(guò)程中，膠原分子之間可以重新進(jìn)行自組裝，緩慢形成新的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為體系的|η*|隨時(shí)間逐漸升高，呈現(xiàn)出正觸變性特征。

圖3 pH對(duì)純膠原分散體系觸變性的影響（膠原濃度：3 mg/mL）

當(dāng)pH=7.2時(shí)，3 mg/mL的純膠原分散體系黏度值最大，酸性或堿性條件均可導(dǎo)致膠原分散體系黏度不同程度的下降，這與汪海波等[8]人的研究結(jié)果一致。但在pH=11.0的條件下，結(jié)構(gòu)恢復(fù)后的膠原分散體系的黏度又有所升高，這主要?dú)w因于在強(qiáng)堿性體系中，膠原表面的凈負(fù)電荷大量增加，從而形成比較強(qiáng)的排斥力，造成膠原纖維之間各類次級(jí)鍵斷裂，二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)也因此遭到毀壞，使得膠原纖維由規(guī)則的聚集體轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮⒌臒o(wú)規(guī)狀態(tài)，使得膠原分散體系黏度上升[9]。

鹽酸胍濃度為0.25 mol/L時(shí)，不同pH條件下膠原體系觸變性的測(cè)定結(jié)果如圖4所示。圖4結(jié)果顯示，在體系結(jié)構(gòu)的恢復(fù)過(guò)程中，4種pH不同的鹽酸胍/膠原分散體系的|η*|隨t均上升，最終趨于平緩，表現(xiàn)為正觸變性特征。

圖4 pH對(duì)0.25 mol/L的鹽酸胍/膠原分散體系觸變性的影響

鹽酸胍作為一種典型的氫鍵破壞劑，可以使膠原分子的構(gòu)象和聚集態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。當(dāng)含量較低時(shí)（c=0.25 mol/L），鹽酸胍只能削弱膠原分子之間的相互作用力，但無(wú)法使膠原變性[10]，膠原體系的結(jié)構(gòu)仍以網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為主，所以體系的復(fù)合黏度|η*|隨t均上升，呈現(xiàn)出正觸變性特征。

當(dāng)pH值為7.2、9.0和11.0時(shí)，|η*|隨t先急劇升高，后趨于平緩，說(shuō)明與酸性條件（pH=5.0）相比，中性和堿性條件更有利于膠原體系的恢復(fù)過(guò)程。

鹽酸胍濃度為1.0 mol/L時(shí)，在不同pH條件下測(cè)定的膠原體系的觸變性結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，當(dāng)pH為7.2時(shí)，體系的|η*|在前250 s內(nèi)迅速升高，達(dá)到最大值后又明顯降低，表現(xiàn)為復(fù)合觸變性；而當(dāng)pH為5.0、9.0和11.0時(shí)，體系的|η*|隨t降低，表現(xiàn)為負(fù)觸變性。

圖5 pH對(duì)1.0 mol/L的鹽酸胍/膠原分散體系觸變性的影響

在中性條件下，當(dāng)濃度增大到1.0 mol/L時(shí)，鹽酸胍可以使少量膠原分子發(fā)生變性，在一定程度上破壞了膠原體系的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；高速預(yù)剪切時(shí)，較高的外加剪切力進(jìn)一步破壞了體系的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，形成了一些尺寸較大的聚集體。而在結(jié)構(gòu)恢復(fù)過(guò)程中的前250 s內(nèi)，這些尺寸較大的聚集體之間可以相互聚集，從而使體系的黏度升高；但隨著測(cè)定時(shí)間的延長(zhǎng)，鹽酸胍可以二次破壞膠原分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使體系的黏度隨時(shí)間再次降低，整個(gè)結(jié)構(gòu)的恢復(fù)過(guò)程總體表現(xiàn)為復(fù)合觸變性特征。而當(dāng)膠原體系的酸性或堿性增加時(shí)（pH為5.0、9.0和11.0），使得聚集體之間的相互排斥作用增強(qiáng)，不易相互靠近形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此體系粘度隨時(shí)間降低，表現(xiàn)出負(fù)觸變性。

鹽酸胍濃度增大至2.0 mol/L時(shí)，不同pH條件下膠原體系觸變性的測(cè)定結(jié)果如圖6所示。可以看出，當(dāng)預(yù)剪切停止后，在4種pH值條件下，體系的復(fù)合黏度隨時(shí)間的延長(zhǎng)迅速降低，約200 s后趨于平緩，呈現(xiàn)出負(fù)觸變性特征。

圖6 pH對(duì)2.0 mol/L的鹽酸胍/膠原分散體系觸變性的影響

當(dāng)濃度較高時(shí)，鹽酸胍對(duì)膠原的變性作用更為顯著，能夠使膠原分子解聚集，甚至破壞膠原分子的三螺旋結(jié)構(gòu)，使多肽鏈發(fā)生解離[11]。在結(jié)構(gòu)的恢復(fù)過(guò)程中，解離出的肽鏈發(fā)生卷縮，致使體系的黏度進(jìn)一步降低，表現(xiàn)出負(fù)觸變性特征。而酸性及堿性條件加劇了鹽酸胍對(duì)膠原的解聚集作用，使體系結(jié)構(gòu)恢復(fù)平衡時(shí)的粘度值遠(yuǎn)低于中性膠原體系。

3 結(jié)論

鹽酸胍作為一種典型的氫鍵破壞劑，可以使膠原發(fā)生構(gòu)象和聚集態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，而pH值可以影響這種變化過(guò)程。當(dāng)濃度增加至1.0 mol/L時(shí)，鹽酸胍可以使少量膠原分子發(fā)生變性，體系在中性條件下表現(xiàn)為復(fù)合觸變性，而在酸性或堿性條件下表現(xiàn)出負(fù)觸變性。而當(dāng)鹽酸胍濃度增加至2.0 mol/L時(shí)，鹽酸胍可以誘導(dǎo)膠原分子解聚集直至解螺旋，使得膠原體系在所研究的pH范圍內(nèi)，皆表現(xiàn)為負(fù)觸變性，酸性及堿性條件能夠加劇鹽酸胍對(duì)膠原的解聚集作用，使結(jié)構(gòu)恢復(fù)平衡時(shí)體系的黏度值遠(yuǎn)低于中性膠原體系。