王光杰，徐麗娜，楊 玲，姜潔露，李 鈞，曲潔靜

（山東同濟測試科技股份有限公司，山東煙臺264004）

在最近幾十年中，獸用抗生素使用量驚人，大量的飼用抗生素作為飼料添加劑長期使用，動物經(jīng)排泄進入糞便、沼液中，造成藥物殘留和耐藥基因的產(chǎn)生，包括動物致病菌和內(nèi)在微生物菌群，進而對人類染病的醫(yī)治和微生態(tài)環(huán)境構成潛在威脅，同時獸用抗生素在肉、蛋、乳等動物產(chǎn)品中殘留通過一般的食品烹飪方法不能完全使其分解，從而對人產(chǎn)生毒副作用和耐藥性。

據(jù)研究報道，對可食用動物使用的抗生素有25%～75%以母體藥物的形式從糞尿中排出體外，并且在土壤中長期滯留[1]。有相當比例的獸藥抗生素以母體藥物或代謝產(chǎn)物的形式通過禽畜糞尿進入水體和土壤中，從而對環(huán)境造成了潛在威脅。

目前，抗生素的含量測定方法有微生物法、高效毛細管區(qū)帶電泳法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法及高效液相色譜法[2-3]等。試驗選擇獨特的樣品處理方法，建立了一種快速、準確、分離度好的高效液相色譜質譜法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Waters H-class型與AB SCIEX API 4000 Plus型液相色譜質譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源（ESI源）；SPE固相萃取裝置；氮吹儀；分析天平：感量分別為0.001 g和0.000 01 g；高速冷凍離心機：轉速≥10 000 r/min；冷凍干燥機等。

1.2 主要試劑耗材

標準物質均為有證標準物質，購于壇墨質檢、Sigma等，純度≥98%；乙腈（色譜純），德國Merck公司提供；EDTA（分析純），國藥集團化學試劑有限公司提供；其他試劑均為分析純；試驗用水為蒸餾水或去離子水；HLB固相萃取柱（200 g/6 L），美國Waters公司提供。

1.3 儀器分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為BEH C18型（1.7 μm，2.1 mm×50 mm），柱溫40℃，進樣體積5 μL；流動相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈；流速0.3 mL/min。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質譜條件

電離方式采用電噴霧離子源正離子模式（ESI+），多反應監(jiān)測（MRM） 檢測，霧化氣為N2。

6種抗生素主要質譜參數(shù)見表2。

表2 6種抗生素主要質譜參數(shù)

1.4 樣品分析步驟

1.4.1 試樣制備

樣品采自當?shù)貍€體養(yǎng)豬場糞便水，靜置后取上層尿液和沼液的水樣加入3 g Na2EDTA，調節(jié)pH值至3～4后過小柱，過柱后若水樣較為渾濁或懸浮雜質較多應過濾處理，水樣采集后3 d內(nèi)完成檢測。

下層糞便經(jīng)-60℃凍干，準確稱取0.2 g干燥脫水樣品于10 mL離心管中，加入10 mL50%的1 mmol/L EDTA甲醇溶液（pH值2），渦旋混勻1 min，超聲10 min后，以轉速4 000 r/min離心5 min，轉移上清液，再重復萃取2次，合并所有上清液，搖勻。

1.4.2 凈化濃縮

HLB固相萃取小柱依次用6 mL二氯甲烷、6 mL甲醇、6 mL Na2EDTA溶液活化，合并提取后水樣以1～2 mL/min流速過柱，富集完成后用10 mL水淋洗，氮吹20 min，用10 mL 3%氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干后用1 mL初始流動相定容，過0.2 μm有機濾膜后進樣分析。

2 結果與分析

2.1 標準品色譜圖

12種抗生素MRM掃描質譜圖見圖1。

圖112 種抗生素MRM掃描質譜圖

12種標準物質保留時間分別為3.09，3.48，1.60，3.25，2.00，3.24，3.26，2.99，3.14，3.01，3.22，3.63 min。在豬糞便、豬尿和沼液水樣中分別添加12種藥物，以10倍信噪比（S/N） 計算，在進樣量10 μL時，得到此方法最低檢測質量濃度為0.05～3.00 ng/mL。

2.2 工作曲線

將12種標準物質稀釋至1～100 μg/L，按上述儀器條件進行分析，以定量離子對的相應峰面積和對應質量濃度進行線性回歸得到標準曲線。

12種抗生素線性回歸曲線及檢出限見表3。

表3 12種抗生素線性回歸曲線及檢出限

2.3 實際樣品分析

在豬糞便、豬尿和沼液水樣中添加10 ng/mL的標準溶液進行加標回收，采用外標法定量，結果顯示12種標準物質在水樣中的回收率為62.5%～105.2%。

12種抗生素加標回收率見表4。

表4 12種抗生素加標回收率/%

3 結論

建立了多種抗生素一次處理進樣快速有效的檢測方法，在實際樣品豬糞便、豬尿和沼液水樣中添加多種抗生素平均回收率為62.5%～105.2%。該法具有快速、穩(wěn)定、靈敏、高效等特點，適用于環(huán)保行業(yè)對多種抗生素的檢測，可廣泛推廣于企業(yè)作為常規(guī)檢測的方法。