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1.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003； 2.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵犯關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍軟組織為主要特征的全身性自身免疫病。RA在全球的患病率為0.5%～1.0%，是臨床常見的難治性疾病，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量[1-2]。目前RA發(fā)病機(jī)制仍不清楚，近來研究發(fā)現(xiàn)RA的發(fā)病與體內(nèi)白介素17(interleukin 17，IL-17)的表達(dá)有關(guān)[3-4]。IL-17是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)白介素家族成員，其參與了RA的發(fā)病及病情進(jìn)展，主要由Th17細(xì)胞分泌而產(chǎn)生，具有強(qiáng)大的致炎作用，在RA的發(fā)病及病情進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，成為近年來研究的一個(gè)熱點(diǎn)[5-7]。IL-17具有很強(qiáng)的促炎作用，能誘導(dǎo)IL-6、IL-22、IL-23等炎癥因子的產(chǎn)生，加強(qiáng)炎癥的表達(dá)，而這些炎癥因子反過來又能進(jìn)一步促進(jìn)Th17的活化[8]。Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)等細(xì)胞因子，可以抑制Th17細(xì)胞，從而起到抗炎的作用；但I(xiàn)FN-γ的促炎效應(yīng)及抑炎效應(yīng)均有報(bào)道，故其屬于促炎因子還是抗炎因子仍存在一定的爭議[9]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)主要產(chǎn)生IL-4、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等抗炎因子，在調(diào)節(jié)免疫紊亂，維持免疫耐受等方面發(fā)揮作用[10-11]。

RA屬中醫(yī)“痹證”、“歷節(jié)”、“尪痹”、“白虎病”等范疇。有研究發(fā)現(xiàn)不同中醫(yī)證型的RA患者，其在年齡、病程、地域、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)及檢查等方面存在差異[12-13]，但RA患者IL-17及其相關(guān)炎癥因子與中醫(yī)證型之間關(guān)系的研究卻寥寥無幾。因此，本研究通過檢測RA不同中醫(yī)證型患者血清中IL-17及其相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平，探討IL-17及其相關(guān)炎癥因子與RA中醫(yī)證型之間的內(nèi)在聯(lián)系，以期為RA的臨床辨證分型及治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康對(duì)照組來源于貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院體檢中心,已排除高血壓、糖尿病等長期慢性疾病，且實(shí)驗(yàn)室檢測各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍的健康志愿者外周血標(biāo)本30例，其中男性11例、女性19例，年齡18～60歲，平均年齡(46.25±14.55)歲。選取2017年6月至12月在貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院RA患者120例，其中男性9例、女性111例，年齡21～70歲，平均年齡(52.32±10.17)歲，病程1個(gè)月至26年，平均病程(59.73±11.28)月。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 120例RA患者均符合2010年ACR/EULAR中對(duì)RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]，并根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》[15]將RA患者分為濕熱痹阻、寒濕痹阻、痰瘀痹阻、肝腎虧虛4個(gè)證型各30例。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合RA西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)和中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡在18～70歲的患者；未伴有其它影響治療和檢測指標(biāo)的疾??；近3個(gè)月未應(yīng)用非甾體抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療；愿接受檢測治療者，并簽訂知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者；嚴(yán)重心腦肝腎功能不全及伴隨其它惡性腫瘤者；患者不能合作者。

1.5 實(shí)驗(yàn)試劑 PharmingenTMFITC Mouse Anti-Human CD3(美國BD公司，批號(hào)：5320730)；PharmingenTMPerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD8(美國BD公司，批號(hào)：7096834)；PharmingenTMLeukocyte Activation Cocktail，with BD GolgiPlugTM(美國BD公司，批號(hào)：7030717)；PharmingenTMAlexa Fluor? 647 Mouse anti-Human IL-17A(美國BD公司，批號(hào)：7132681)；Fixation/Permeabilization Solution Kit RUO(美國BD公司，批號(hào)：6292704)；人白介素4(IL-4)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(武漢華美生物科技有限公司，批號(hào)：N26015213)；人白介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(武漢華美生物科技有限公司，批號(hào)：N26011217)；人白介素17(IL-17)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(武漢華美生物科技有限公司，批號(hào)：N26015431)；人白介素22(IL-22)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(武漢華美生物科技有限公司，批號(hào)：N27147789)；人白介素23(IL-23)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(武漢華美生物科技有限公司，批號(hào)：N28015215)；人干擾素γ(IFN-γ)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(武漢華美生物科技有限公司，批號(hào)：N26011127)；人轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(武漢華美生物科技有限公司，批號(hào)：N24015112)。

1.6 實(shí)驗(yàn)儀器 臺(tái)式低速離心機(jī)(長沙平凡儀器儀表有限公司，TDL8M)；BD FACSCantoTM II型流式細(xì)胞儀(美國BD公司，V33947300248)；電熱恒溫水浴箱[北京醫(yī)療設(shè)備廠，(S)HHW21]；無菌流式管(貴州泰思騰生物科技有限公司，922746)；CO2培養(yǎng)箱(上海華連醫(yī)療器械公司，DH25000)；酶標(biāo)分析儀(深圳市凱特生物醫(yī)療電子科技有限公司，YZB/粵0198-2012)；洗板機(jī)(深圳市凱特生物醫(yī)療電子科技有限公司，KWP-100A)。

1.7 外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)中IL-17表達(dá)檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測。取2 mL新鮮抗凝血與PBS液2 mL混勻，加入4 mL人淋巴分離液中，2000 r離心20 min，吸取乳白色單核細(xì)胞層即為PBMC，加入1 mLPBS液洗滌1次，配置250 μLPBMC；加入250 μL RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，加入250xBD PharmingenTMLeukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlugTM(刺激阻斷劑)2 μL，震蕩混勻，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱4～6 h；加入20 μL BD PharmingenTMFITC Mouse Anti-Human CD3及5 μL BD PharmingenTMPerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD8，混勻，室溫避光30 min；加入Fixation/Permeabilization Solution Kit RUO(破膜劑)1 mL，室溫避光30 min；加入PBS液1 mL，1500 r離心5 min，棄上清；加入PBS液1 mL，將細(xì)胞懸液分為兩份，分別加入20 μL BD PharmingenTMAlexa Fluor? 647 Mouse anti-Human IL-17A及Alexa Fluor? 647 Mouse IgG1 K Isotype control，4℃避光孵育30 min；再加入1 mL流式染色緩沖液洗滌1次，1500 r離心5 min，棄上清；加入PBS液500 μL重懸后上機(jī)檢測，用流式細(xì)胞儀分析外周血CD3+CD8-IL-17+表達(dá)的百分率。

1.8 血清IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的水平檢測 采用ELISA法檢測。RA患者及健康對(duì)照組清晨空腹抽取外周靜脈血，離心后取血清，按照ELISA試劑盒說明書上的步驟檢測血清IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的濃度。

2 結(jié)果

2.1 中醫(yī)證型與性別、年齡、病程的關(guān)系 結(jié)果顯示：不同中醫(yī)證型間在性別、年齡及病程上相比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 中醫(yī)證型與性別、年齡、病程的關(guān)系

2.2 流式細(xì)胞儀檢測各組間CD3+CD8-IL-17+表達(dá)水平比較 與健康對(duì)照組比較，RA患者各組CD3+CD8-IL-17+表達(dá)水平均明顯升高。各組間相互比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。IL-17細(xì)胞的表達(dá)率由高到低依次為濕熱痹阻組、寒濕痹阻組、痰瘀痹阻組、肝腎虧虛組、健康對(duì)照組，見圖1～8、表2。

中醫(yī)證型例數(shù)CD3+CD8-IL-17+/%健康對(duì)照組300.12±0.03寒濕痹阻組305.53±0.78?濕熱痹阻組308.78±1.14?●肝腎虧虛組301.57±0.44?●■痰瘀痹阻組302.79±0.67?●■▲

注：與健康對(duì)照組相比，*P<0.05；與寒濕痹阻組相比，●P<0.05；與濕熱痹阻組相比，■P<0.05；與肝腎虧虛組相比，▲P<0.05。

2.3 ELISA法檢測各組間IL-4、TGF-β1的表達(dá)情況 與健康對(duì)照組相比，RA患者各組IL-4、TGF-β1表達(dá)水平均明顯下降(P<0.05)；肝腎虧虛組、痰瘀痹阻組IL-4、TGF-β1水平明顯高于寒濕痹阻組、濕熱痹阻組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；寒濕痹阻組、濕熱痹阻組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；肝腎虧虛組、痰瘀痹阻組比較亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；IL-4、TGF-β1檢測結(jié)果由高到低排列為健康對(duì)照組>肝腎虧虛組>痰瘀痹阻組>寒濕痹阻組>濕熱痹阻組。見表3。

表3 不同證型組間IL-4、TGF-β1的表達(dá)水平比較

注：與健康對(duì)照組相比，aP<0.05；與寒濕痹阻組相比，bP<0.05；與濕熱痹阻組相比，cP<0.05。

2.4 ELISA法檢測各組間IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的表達(dá)情況 與健康對(duì)照組相比，寒濕痹阻組、濕熱痹阻組、肝腎虧虛組、痰瘀痹阻組IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；濕熱痹阻組、寒濕痹阻組IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ水平明顯高于肝腎虧虛組、痰瘀痹阻組，有顯著性差異(P<0.05)；濕熱痹阻組、寒濕痹阻組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；肝腎虧虛組、痰瘀痹阻組比較亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ檢測結(jié)果由高到低排列為濕熱痹阻組>寒濕痹阻組>痰瘀痹阻組>肝腎虧虛組>健康對(duì)照組。見表4。

表4 不同證型與IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的關(guān)系

續(xù)表4

表4 不同證型與IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的關(guān)系

注：與健康對(duì)照組相比，dP<0.05；與肝腎虧虛組相比，eP<0.05；與痰瘀痹阻組相比，fP<0.05。

3 討論

西醫(yī)認(rèn)為RA可由多種免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子共同參與引起慢性炎癥病變，其病理特征是慢性炎癥細(xì)胞浸潤，滑膜增厚、血管新生等，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，功能喪失[16]。RA屬中醫(yī)“痹證”、“歷節(jié)”、“尪痹”、“白虎病”、“骨痹”、“鶴膝風(fēng)”等范疇，主要臨床表現(xiàn)以肢體關(guān)節(jié)、肌肉疼痛、腫脹、酸楚、麻木、重著、變形、僵直、畸形及活動(dòng)受限等癥狀為特征[17]。臨床實(shí)踐證明中醫(yī)藥辨證治療RA療效顯著，但中醫(yī)辨證分型缺乏客觀依據(jù)，且各醫(yī)家見解不同，辨證思路亦有差別，所以遣方用藥及療效評(píng)價(jià)差異較大，RA的中醫(yī)辨證評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)并未統(tǒng)一，影響到臨床的進(jìn)一步推廣。基于以上認(rèn)識(shí)，實(shí)現(xiàn)中醫(yī)現(xiàn)代化，尋找與RA辨證論治相對(duì)應(yīng)且具有可重復(fù)性的客觀醫(yī)學(xué)指標(biāo)具有重要意義，既要遵循中醫(yī)理論，又能適應(yīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展規(guī)律，才能更好地為患者服務(wù)。

本次實(shí)驗(yàn)中對(duì)120例RA患者的研究發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ均在RA各證型間存在顯著差異，且明顯高于正常對(duì)照組，其在血清中的濃度由高到低依次為：濕熱痹阻組、寒濕痹阻組、痰瘀痹阻組、肝腎虧虛組、健康對(duì)照組，4種證型中濕熱痹阻型RA患者IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ的表達(dá)水平升高最顯著，提示濕熱痹阻型RA患者可能更多處于病情活動(dòng)期，其自身免疫處于活躍狀態(tài)；從中醫(yī)上講，可能因外感濕熱之邪蘊(yùn)結(jié)于內(nèi)，或嗜食肥甘厚膩，脾為濕困，郁而化熱，濕熱壅盛，正邪交爭劇烈有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，濕熱痹阻型、寒濕痹阻型RA患者IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ表達(dá)水平明顯高于肝腎虧虛型與痰瘀痹阻型，后兩型雖有升高，但表達(dá)遠(yuǎn)不如前兩者顯著。RA患者血清中可出現(xiàn)IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ表達(dá)升高，與國內(nèi)外研究報(bào)道相吻合，說明其這些炎癥因子共同參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果與大多數(shù)研究相同，RA患者IFN-γ水平較正常組明顯升高，表明IFN-γ可能在RA中作為促炎因子而發(fā)揮作用。

IL-4、TGF-β1在RA各證型間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且明顯高于正常對(duì)照組，其在血清中的濃度由高到低排列依次為肝腎虧虛組、痰瘀痹阻組、寒濕痹阻組、濕熱痹阻組；說明這兩個(gè)細(xì)胞因子共同抑制了RA炎癥的進(jìn)一步發(fā)展。在國內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn)：IL-4到底是抑制炎癥的表達(dá)還是促進(jìn)炎癥的表達(dá)仍存在爭議[18-20]，本研究結(jié)果與大多數(shù)研究結(jié)果相一致：IL-4抑制了RA炎癥的表達(dá)，但限于本次實(shí)驗(yàn)中樣本數(shù)量有限，未來有待大樣本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行論證。本次研究結(jié)果顯示：無論是活動(dòng)期RA患者還是非活動(dòng)期RA患者，其血清中TGF-β1的表達(dá)水平均顯著低于正常對(duì)照組，且活動(dòng)期RA患者比非活動(dòng)期RA患者血清中TGF-β1的表達(dá)量要更低，這與Valle等[21]的研究結(jié)果相一致。這說明TGF-β1在RA的病程中主要發(fā)揮免疫抑制作用，其表達(dá)量水平下降可引起RA患者調(diào)節(jié)免疫的活性下降。

本研究以炎癥細(xì)胞因子為切入點(diǎn)，通過ELISA和流式細(xì)胞術(shù)檢測不同中醫(yī)證型RA患者血清中IL-4、IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TGF-β1的表達(dá)水平及IL-17在淋巴細(xì)胞中所占的比例，探討IL-17及相關(guān)炎癥因子與RA中醫(yī)證型之間的關(guān)系，未來可將更多的炎癥因子參與到RA不同中醫(yī)證型的研究中來，更好地為中醫(yī)辨證分型及治療提供依據(jù)和借鑒。