胡光云 宋 陽 孫 哲 甄玉花 全小明 王一飛

(1 陸軍軍醫(yī)大學(xué)護(hù)理系，重慶市 400038，電子郵箱：2234381336@qq.com：2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，廣東省廣州市 510405；廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院3 腫瘤科，4 護(hù)理部，廣東省廣州市 510405)

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)最常見的良性腫瘤之一，主要由平滑肌細(xì)胞增殖引起[1]，常見于30～50歲婦女，患病率呈逐年上升趨勢。研究表明，子宮肌瘤是未絕經(jīng)婦女行全子宮切除的最主要原因[2]。但該病發(fā)病機(jī)制雜，目前尚未完全明確[3]，需要進(jìn)行體外細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等研究進(jìn)一步探討[4]。體外細(xì)胞模型的建立是研究本病發(fā)生機(jī)制及防治措施的有效手段，但原代細(xì)胞培養(yǎng)存在貼壁率低、復(fù)蘇存活率低等特點(diǎn)。本研究旨在不影響培養(yǎng)效果的前提下，改良原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，為子宮肌瘤的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 本研究所用病理組織取自在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院行全子宮切除術(shù)或行子宮肌瘤剔除術(shù)的15例子宮肌瘤患者。患者年齡35～50(43.0±5.0)歲，術(shù)前至少3個(gè)月沒有接受激素治療，術(shù)后病理學(xué)診斷為子宮肌瘤。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備 杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)購自Gibco公司(批號：25200-056)，胎牛血清購自Gibco公司(批號：10270-106)，青霉素/鏈霉素購自南京凱基生物公司生產(chǎn)(批號：15140-122)，胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)購自南京凱基生物公司(批號：25200-056)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)購自HyClone公司(批號：SH30256.01)，Ⅰ型膠原酶購自Sigma公司(批號：C0130)，平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體購自Abcam公司(批號：ab134813)。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(NAPCO公司，型號：Series 5400)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning公司)，LX70倒置顯微鏡(Olympus公司，型號：CX41)，全自動(dòng)拍照裝置(Lumenera公司INFINITYLite系列，型號：PMZO-35)，水浴箱：(德國Memert公司)，低速離心機(jī)(ANKE公司，型號：TDL-5c)，超低溫冰箱(SANYO公司，型號：MDF-U53V)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人子宮肌瘤組織的保存：在無菌操作下取數(shù)塊子宮肌瘤瘤核組織塊，大小約為1 cm3，將組織塊分為常規(guī)組及改良組。將常規(guī)組標(biāo)本置于4℃ PBS中(內(nèi)含青霉素/鏈霉素1 000 IU /ml)，改良組標(biāo)本放入Hank液(Gibco公司，批號：8118275)(內(nèi)含青霉素/鏈霉素1 000 IU/ml)中，低溫(0～4℃)條件下迅速送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3.2 原代細(xì)胞的獲取與細(xì)胞培養(yǎng)：(1)常規(guī)組采用膠原酶消化法獲得人子宮肌瘤原代細(xì)胞：參照韓虹娟等[5]改進(jìn)的人子宮肌瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法獲取原代細(xì)胞，首先將子宮肌瘤組織塊放入含PBS(含3%青霉素/鏈霉素)的無菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行梯度漂洗3次，除去血跡及組織外層；然后將漂洗好的組織塊移入無血清DMEM培養(yǎng)基，用彎鑷和眼科剪將組織塊修剪成約1 mm3大??；最后用無菌吸管將修剪后的組織小塊及DMEM液移至50 ml的離心管中，待組織沉淀后棄上清，并向管中加入0.2%的Ⅰ型膠原酶10 ml，37℃水浴消化1.5～2 h(每30 min搖晃1次)，組織塊明顯變小且消化液變渾濁后，加入足量的完全培養(yǎng)基終止消化；1 000 r/min離心10 min棄上清，再用200目的細(xì)胞篩過濾收集濾液，將細(xì)胞接種于25 cm3培養(yǎng)瓶中，加入20%的完全培養(yǎng)基(DMEM+20%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素)后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞貼壁進(jìn)行第1次換液，以后每48 h換液1次，待細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。(2)改良組采用改良的膠原酶消化法獲得原代細(xì)胞：漂洗、修剪組織過程同常規(guī)組，將約1 mm3大小的組織塊移至50 ml的離心管，待組織沉淀后棄上清，加入0.2%的Ⅰ型膠原酶(膠原酶與組織塊體積比例為2 ∶1)消化，混合均勻后，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。消化2 h后，搖晃離心管，再消化5～6 h，組織塊明顯變小且消化液變渾濁后，用200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，收集濾液，濾液加入完全培養(yǎng)基終止消化，培養(yǎng)基與膠原酶體積比為2 ∶1；濾網(wǎng)上的組織塊再次放入50 ml離心管中，加入膠原酶(組織塊與膠原酶體積比為1 ∶1)再次消化，再次消化1 h后過濾組織懸液，收集細(xì)胞懸液，終止消化。將兩次終止消化后的細(xì)胞懸液，以1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素)吹打均勻，再次1 000 r/min離心5 mim，棄上清，將細(xì)胞接種于25 cm3培養(yǎng)瓶中，加入10%的完全培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，每48 h換液1次，待細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。

1.3.3 細(xì)胞的凍存：從傳帶后第2代開始，待細(xì)胞融合80%時(shí)準(zhǔn)備凍存，凍存前一晚換液，按細(xì)胞傳代方法獲取細(xì)胞懸液，離心過程中按PBS ∶胎牛血清 ∶二甲基亞砜為6 ∶3 ∶1 配置凍存液，放入4℃的冰箱中待用。細(xì)胞離心結(jié)束，倒掉上層清液，將預(yù)冷好的凍存液緩慢加入離心管中，吹打均勻后放入凍存管，靜止幾分鐘，寫明凍存細(xì)胞種類，凍存日期，放入程序降溫盒，凍存24 h后，移至-80℃的冰箱。

1.3.4 子宮肌瘤細(xì)胞的復(fù)蘇：迅速從-80℃冰箱中取出凍存管，直接浸入37℃恒溫水浴箱中，并不時(shí)搖動(dòng)使其盡快融化。注意不可使水浸沒瓶蓋，以避免污染。然后從37℃水浴箱中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，放入離心管并滴加10倍以上含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基混勻，1 000 r/min離心5 min ，棄上清，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換1次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 細(xì)胞形態(tài)觀察及細(xì)胞鑒定：細(xì)胞貼壁后，在倒置顯微鏡下直接觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長情況，并應(yīng)用全自動(dòng)拍照系統(tǒng)記錄細(xì)胞的形態(tài)變化；培養(yǎng)至第3代，采用α-平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定細(xì)胞，評估細(xì)胞首次傳代成功的時(shí)間。傳代周期為5～7 d，傳至第3～5代時(shí)細(xì)胞形態(tài)均勻，生長良好，質(zhì)量穩(wěn)定，經(jīng)鑒定后用于實(shí)驗(yàn)[5]。

1.4.2 獲得細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞貼壁率：(1)兩組均于終止消化后，收集細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。(2)將原代細(xì)胞分別以(5～10)×107個(gè)/L接種于含有10% 完全培養(yǎng)基的25 mm3培養(yǎng)皿中，于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，吸取上清液，計(jì)算細(xì)胞貼壁率：細(xì)胞貼壁率=(接種細(xì)胞數(shù)-上清細(xì)胞數(shù))/接種細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次的平均值為細(xì)胞貼壁率。

1.4.3 細(xì)胞傳代次數(shù)及復(fù)蘇情況：(1)如在顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)均勻、生長良好、質(zhì)量穩(wěn)定，則評定為生長良好的細(xì)胞，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞體積增大、細(xì)胞核凹陷、核膜崩解等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化時(shí)，說明細(xì)胞已出現(xiàn)衰老[6]，不宜再進(jìn)行傳代培養(yǎng)，記錄兩組細(xì)胞可傳代培養(yǎng)的次數(shù)。(2)取凍存后的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，24 h后如鏡下觀察到細(xì)胞融合50%～60%，則說明復(fù)蘇成功。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人子宮肌瘤原代細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞鑒定 倒置顯微鏡下可見兩組細(xì)胞均呈長梭形，放射狀生長，成束的細(xì)胞平行排列，部分區(qū)域細(xì)胞多層重疊，部分呈單層，高低起伏呈現(xiàn)平滑肌細(xì)胞特征性的“峰-谷”狀生長[5]，見圖1～2。免疫組化鑒定結(jié)果顯示α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體呈陽性反應(yīng)，光鏡下細(xì)胞輪廓清楚，中央有卵圓形的核，核仁及胞質(zhì)清晰， 核旁可見空泡， 胞漿飽滿，見圖3～4。

圖1 改良組子宮肌瘤原代細(xì)胞形態(tài)圖2 常規(guī)組子宮肌瘤原代細(xì)胞形態(tài)圖3 改良組免疫組化鑒定(×100)圖4 常規(guī)組免疫組化鑒定(×100)

2.2 兩組細(xì)胞數(shù)、貼壁率和首次傳代時(shí)間比較 改良組獲取的細(xì)胞數(shù)多于常規(guī)組，貼壁率高于常規(guī)組，首次傳代時(shí)間短于常規(guī)組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組細(xì)胞數(shù)及貼壁率、首次傳代時(shí)間比較(x±s)

2.3 兩組細(xì)胞傳代次數(shù)及復(fù)蘇情況比較 改良組細(xì)胞傳代(6.60±0.83)次，常規(guī)組細(xì)胞傳代(6.33±0.72)次，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.943，P=0.356)。兩組細(xì)胞均復(fù)蘇成功。

3 討 論

子宮肌瘤體外細(xì)胞模型可用于藥物敏感性實(shí)驗(yàn)及疾病機(jī)制的相關(guān)研究，但原代細(xì)胞體外培養(yǎng)困難[7]，程序復(fù)雜，無菌要求嚴(yán)格，細(xì)胞生長受到培養(yǎng)基、操作方法、培養(yǎng)環(huán)境及無菌條件等諸多因素影響[8]。具有重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、純度高等優(yōu)點(diǎn)的細(xì)胞體外培養(yǎng)方法是培養(yǎng)人子宮肌瘤細(xì)胞系的關(guān)鍵，也是相關(guān)實(shí)驗(yàn)的能否順利進(jìn)行的基本保障[9]。

3.1 強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)的無菌操作 無菌操作關(guān)乎每一個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，包括標(biāo)本取材過程，器械的清洗、消毒、保存，培養(yǎng)液的配置，雙抗等試劑的添加等，任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)紕漏均會使細(xì)胞發(fā)生污染，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗[10]。

3.2 組織塊運(yùn)輸過程中緩沖液的選擇 肌瘤組織離體后，組織塊即使處于低溫環(huán)境中也仍在進(jìn)行代謝。在國內(nèi)多采用PBS或DMEM來暫存組織標(biāo)本。PBS是只含有磷酸根、鈉、鉀、氯離子的鹽平衡緩沖液，不能為細(xì)胞提供暫時(shí)的營養(yǎng)；DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基，但缺少必需的鹽離子[11]；而Hank液中鹽成分較PBS復(fù)雜，且含有葡萄糖，可為細(xì)胞提供簡單的營養(yǎng)。本研究中，改良組在取材過程中采用Hanks液代替PBS或DMEM，結(jié)果顯示改良組原代細(xì)胞貼壁率高于常規(guī)組，細(xì)胞活性高于常規(guī)組(均P<0.05)，這可能與肌瘤組織離體后Hanks液能有效保護(hù)組織細(xì)胞的活力有關(guān)。

3.3 膠原酶消化時(shí)間及二次消化 研究表明，在進(jìn)行人子宮肌瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，分別用膠原酶消化0.5 h和6 h，均能成功培養(yǎng)出原代子宮肌瘤細(xì)胞[5，12]。本研究中，常規(guī)組消化時(shí)間1.5～2 h，而改良組的消化時(shí)間改為4～7 h，并根據(jù)組織韌度的不同調(diào)整消化時(shí)間，如韌性大、質(zhì)硬組織的消化時(shí)間相對較長。結(jié)果顯示改良組仍能獲得較多細(xì)胞，且細(xì)胞的貼壁率高于常規(guī)組(P<0.05)。這可能與二次消化可將組織深層的細(xì)胞不斷暴露于消化酶中,進(jìn)而獲得更多的細(xì)胞有關(guān)。筆者還發(fā)現(xiàn)二次消化時(shí)間過長可導(dǎo)致細(xì)胞損傷，建議二次消化的時(shí)間為1～2 h。

3.4 兩組細(xì)胞形態(tài)及平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體對比 兩組細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、大小、排列方式基本相似。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白含量變化是判斷平滑肌細(xì)胞表型變化的主要依據(jù)[13]。本研究中，免疫組化鑒定結(jié)果顯示α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體呈陽性反應(yīng)，提示所培養(yǎng)的細(xì)胞為子宮肌瘤細(xì)胞，且細(xì)胞表型未發(fā)生明顯變化。

綜上所述，改良的人子宮肌瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法是一種能快速獲得較多人子宮肌瘤細(xì)胞的簡便且可行的方法，能有效縮短細(xì)胞首次傳代時(shí)間，保證較多的傳代次數(shù)及較高的復(fù)蘇成功率，其所培養(yǎng)的原代細(xì)胞具有較高的貼壁率及純度。