溫海燕 宋金春

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北省武漢市 430060，電子郵箱：wenhaiyan2000@126.com)

膦甲酸鈉為非核苷類的抗病毒藥物，可有效阻斷病毒DNA復(fù)制，具有廣譜抗病毒作用[1]。膦甲酸鈉在臨床上主要以注射液進(jìn)行全身給藥，常用于治療艾滋病相關(guān)的巨細(xì)胞病毒感染、抗耐核苷類藥物病毒等，療效顯著。膦甲酸鈉在體內(nèi)主要的毒性靶器官為腎臟，因此在臨床抗病毒治療過(guò)程中易產(chǎn)生腎毒性[2-5]。此外，肝臟也是藥物代謝的一個(gè)重要器官。目前，尚無(wú)膦甲酸鈉對(duì)肝腎功能影響的研究。本研究分析不同劑量膦甲酸鈉對(duì)大鼠肝腎組織及相關(guān)生化病理指標(biāo)的影響，為臨床安全應(yīng)用膦甲酸鈉提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 膦甲酸鈉氯化鈉注射液(批號(hào)：21707072-1；規(guī)格：3 g:250 ml)與膦甲酸鈉原料藥均由武漢大安制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：1704261)，無(wú)菌生理鹽水，甲醇、乙腈(色譜純)，4%多聚甲醛溶液。

1.2 主要儀器 ADVIA 2400型全自動(dòng)生化分析儀由西門(mén)子公司生產(chǎn)，Sorvall Fresco型微量臺(tái)式離心機(jī)由德國(guó)賀利氏公司生產(chǎn)，YXJ-1型高速離心機(jī)由深圳天南海北實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)，XW-80A型渦旋混合儀由上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠生產(chǎn)，TG328A型電子分析天平由上海天平儀器廠生產(chǎn)，ECLIPSE Ti-SR型倒置熒光顯微鏡由日本尼康公司生產(chǎn)，DS-U3型成像系統(tǒng)由日本尼康生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 無(wú)特定病原體級(jí)SD大鼠40只由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供[湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：42000600025186；許可證號(hào)：SYXK(鄂)2015-0018]，雌雄各半，體重(200±30)g。以標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水喂養(yǎng)，室內(nèi)溫度為(23±2)℃，相對(duì)濕度為60%～70%，12 h交替照明。待適應(yīng)環(huán)境后采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只。低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠分別給予腹腔注射300 mg/kg、600 mg/kg、900 mg/kg的膦甲酸鈉注射液，對(duì)照組給予腹腔注射等體積生理鹽水。每日上午10時(shí)稱大鼠體重后，根據(jù)體重給予藥物，連續(xù)注射2周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般情況：在給藥期間內(nèi)觀察動(dòng)物的狀況，包括毛發(fā)、糞便與尿液、行為動(dòng)作、體重變化等。每天給藥后稱重計(jì)算當(dāng)天的體重增長(zhǎng)率，最終取2周體重增長(zhǎng)率的平均值，體重增長(zhǎng)率=(給藥后的體重-未給藥前的體重)/未給藥前體重×100%。

1.4.2 尿液指標(biāo)：給藥2周后，用代謝籠收集大鼠24 h尿液，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定尿總蛋白、尿肌酐指標(biāo)，計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率(creatinine clearance，CCr)，CCr=尿肌酐/血肌酐×每分鐘的尿量(ml/min)。

1.4.3 血液指標(biāo)：給藥2周后，自大鼠心臟抽取全血3 ml后處死，置離心管中于室溫靜置1 h后，于3 500 r/min離心10 min，分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT、AST、尿素氮、肌酐、TG及AKP濃度。

1.4.4 肝腎組織形態(tài)學(xué)改變情況： 大鼠處死后完整分離肝臟及雙側(cè)的腎臟組織，用生理鹽水沖洗去除多余組織和污血，用紗布輕輕吸干多余水分后稱量，根據(jù)臟器質(zhì)量及大鼠體重?cái)?shù)計(jì)算相應(yīng)的臟器系數(shù)。臟器指數(shù)(%)=臟器重量(g)/大鼠體重(g)×100%。取大鼠肝臟的同一部位組織及同一側(cè)的腎臟組織，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，依次進(jìn)行脫水、包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 給藥期間，對(duì)照組及低劑量組大鼠一般情況良好，飲食、毛發(fā)、行為均正常，未出現(xiàn)死亡。中、高劑量組大鼠出現(xiàn)脫毛，每次給藥后的2～3 h內(nèi)出現(xiàn)四肢抽搐，精神狀況差，食欲不振的現(xiàn)象，當(dāng)日下午該現(xiàn)象基本消失。此外，高劑量組大鼠還存在腹瀉，尿液變黃，消瘦等現(xiàn)象，其中中劑量組大鼠未出現(xiàn)死亡，高劑量組在后期給藥過(guò)程中出現(xiàn)4只死亡，補(bǔ)入相應(yīng)數(shù)量的大鼠繼續(xù)進(jìn)行給藥滿2周。

2.2 4組大鼠體重增長(zhǎng)率及臟器指數(shù)比較 與對(duì)照組相比，低劑量組體重增長(zhǎng)率和肝臟指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，但腎臟指數(shù)高(P<0.05)；與對(duì)照組及低劑量組相比，中劑量組和高劑量組的體重增長(zhǎng)率均低，而肝臟及腎臟指數(shù)均高(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠體重增長(zhǎng)率及臟器指數(shù)比較(x±s，%)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05。

2.2 4組大鼠肝、腎病理組織形態(tài)改變 (1)正常對(duì)照組的大鼠肝臟結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞呈多面體型，肝細(xì)胞索排列清晰，從中央靜脈向四周呈輻射狀整齊排列，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，部分存在雙核，內(nèi)皮細(xì)胞扁平，環(huán)繞在中央靜脈周?chē)]清晰，組織無(wú)腫脹壞死現(xiàn)象；低劑量組大鼠肝臟與對(duì)照組形態(tài)相似；而中、高劑量組大鼠肝細(xì)胞腫脹變大，細(xì)胞間界限模糊，肝細(xì)胞索排列趨于紊亂，血竇模糊，中央靜脈變小。見(jiàn)圖1。(2)對(duì)照組大鼠的腎臟結(jié)構(gòu)完整，腎小球清晰無(wú)破損，腎小球囊腔大小均勻，腎小管刷邊界正常；低劑量組大鼠的腎小球囊腔變大，腎小管排列形態(tài)發(fā)生改變，腎小管刷邊界模糊；中、高劑量組大鼠的病變加重，腎臟結(jié)構(gòu)完整性破壞，腎小管與腎小球排列紊亂，腎小管上皮細(xì)胞和腎小球細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣病變，腎小管囊腔面積很大，近曲小管上皮細(xì)胞發(fā)生脫落，腎臟結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損。見(jiàn)圖2。

對(duì)照組 低劑量組 中劑量組 高劑量組

圖1 4組大鼠肝臟病理組織切片(HE染色，×400)

對(duì)照組 低劑量組 中劑量組 高劑量組

圖2 4組大鼠腎臟病理組織切片(HE染色，×400)

2.3 4組大鼠肝腎功能相關(guān)指標(biāo)比較 (1)肝功能：給藥2周后，與對(duì)照組相比，低劑量組的AST及AKP均高(均P<0.05)；與對(duì)照組及低劑量組相比，高、中劑量組的ALT、AST、AKP及TG水平均高(均P<0.05)，見(jiàn)表2。(2)腎功能：與對(duì)照組相比，低高劑量組血尿素氮及肌酐、尿液總蛋白均高(均P<0.05)，而尿肌酐以及CCr值均低(均P<0.05)； 與對(duì)照組及低劑量組相比，中、高劑量組血尿素氮及肌酐、尿液總蛋白均高(均P<0.05)，而尿肌酐以及CCr值均低(均P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 4組大鼠給藥后肝功能比較(x±s)

注：與對(duì)照組比較， *P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05。

表3 4組大鼠給藥后腎功能比較(x±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05。

3 討 論

3.1 給藥劑量的確定 參考文獻(xiàn)[6-7]及膦甲酸鈉的說(shuō)明書(shū)，根據(jù)治療疾病及患者狀況對(duì)其劑量進(jìn)行個(gè)體化調(diào)整。膦甲酸鈉用于病毒感染誘導(dǎo)治療的劑量為60 mg/kg，維持劑量為90～120 mg/kg，而用于皮膚感染治療的劑量為40 mg/kg。根據(jù)人與大鼠等劑量之間的換算[8]，成人的體重視為標(biāo)準(zhǔn)體重60 kg，成人劑量按皮膚感染治療(40～60 mg/kg)的中間劑量，即50 mg/kg計(jì)算，將成人劑量與大鼠劑量按體表面積等效劑量進(jìn)行換算得大鼠劑量為299 mg/kg，同時(shí)，為便于計(jì)算給藥，按300 mg/kg給藥，并設(shè)該劑量為低劑量。此外，根據(jù)膦甲酸鈉的最大溶解度及大鼠腹腔注射的最大注射量，中、高劑量則分別設(shè)為低劑量的2、3倍，即600 mg/kg、900 mg/kg。

3.2 膦甲酸鈉對(duì)大鼠體重增長(zhǎng)率及臟器系數(shù)的影響 在給藥期間，所有大鼠均給予常規(guī)的飲食飼養(yǎng)。對(duì)照組與低劑量組大鼠的體重增長(zhǎng)穩(wěn)定，而中劑量組大鼠的體重增長(zhǎng)較慢，高劑量組大鼠體重則降低。功能正常的動(dòng)物臟器與體重變化較為穩(wěn)定，兩者的比值即臟器指數(shù)也較為恒定[9]。當(dāng)臟器受損后，可能會(huì)出現(xiàn)充血、水腫、組織異常肥大增生等，這使得臟器系數(shù)增大；而出現(xiàn)器官萎縮時(shí)，則臟器指數(shù)減小。本研究中，與對(duì)照組比較，中劑量組和高劑量組的體重增長(zhǎng)率均低，而肝臟及腎臟指數(shù)均高(均P<0.05)；低劑量組體重增長(zhǎng)率和肝臟指數(shù)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，但腎臟指數(shù)高(P<0.05)。其原因可能為中、高劑量大鼠在給藥過(guò)程中出現(xiàn)明顯的腹瀉，食欲不振的現(xiàn)象，體重變化大，使得臟器指數(shù)變大；另外，在給藥后期，高劑量的大鼠出現(xiàn)4只死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)其肝臟出現(xiàn)輕微肥大，腎臟顏色變白，出現(xiàn)異常水腫肥大現(xiàn)象，而其他組織正常，這也導(dǎo)致臟器指數(shù)變大。這表明中、高劑量的膦甲酸鈉對(duì)大鼠肝臟和腎臟均具有損害作用，而低劑量組對(duì)肝臟無(wú)顯著的損害作用，但對(duì)腎臟具有一定的損害。

3.3 膦甲酸鈉對(duì)肝、腎功能及組織形態(tài)學(xué)的影響 當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，存在于其中的ALT、AST會(huì)釋放入血，導(dǎo)致其血液含量升高，兩者是評(píng)價(jià)肝功能的常見(jiàn)指標(biāo)[10]。AKP主要存在于肝、腎、骨骼等組織，通過(guò)肝臟向膽排出。當(dāng)發(fā)生肝膽病變時(shí)，由于肝內(nèi)膽道膽汁排泄障礙，肝細(xì)胞過(guò)度產(chǎn)生的AKP無(wú)法順利排出而反流入血，導(dǎo)致血液中AKP含量升高。TG含量的變化可能與脂肪肝、高血脂等疾病有關(guān)[11]。肌酐與尿素含量的變化與腎功能密切相關(guān)，兩者都主要通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)排出體外，當(dāng)腎小球受損時(shí)，兩者在血液中無(wú)法正常濾過(guò)導(dǎo)致含量升高。其中，血肌酐和尿肌酐的變化可通過(guò)CCr來(lái)反映，當(dāng)CCr顯著降低時(shí)，表明腎小球過(guò)濾功能受損。此外，在正常情況下，尿液中不含或僅含微量的蛋白，當(dāng)腎臟受損時(shí)，導(dǎo)致尿蛋白無(wú)法重吸收，使得尿液中的蛋白含量上升。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低劑量組部分肝功能指標(biāo)高，但數(shù)值變化在合理范圍之內(nèi)，且肝臟系數(shù)無(wú)明顯變化，組織理形態(tài)也較為完整，提示低劑量膦甲酸鈉對(duì)肝臟的損害作用較??；中、高劑量組的ALT、AST、AKP及TG水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)，且大鼠肝臟的組織形態(tài)存在一定的破壞，但在病理組織圖中肝臟紋路較為清晰，提示中、高劑量膦甲酸鈉可損害肝臟，但損害作用較輕，該作用機(jī)制還待進(jìn)一步研究。而與對(duì)照組相比，不同劑量組血尿素氮及肌酐、尿液總蛋白均高(均P<0.05)，而尿肌酐以及CCr值均低(均P<0.05)，腎小管和腎皮質(zhì)均出現(xiàn)不同程度的破壞，其中中、高劑量組大鼠的腎臟結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，提示不同劑量膦甲酸鈉均可損害腎臟，且較肝臟損害更為嚴(yán)重。這可能是由于高劑量的膦甲酸鈉經(jīng)腎臟排泄過(guò)程中產(chǎn)生結(jié)晶，從而造成腎臟損傷，但通常這種損傷都是可逆的，停藥一段時(shí)間后恢復(fù)[12-13]。有研究表明，靜脈注射一定量的生理鹽水或飲用大量水可水化膦甲酸鈉，明顯降低腎毒性[14-15]。此外，與低劑量組相比，中、高劑量組ALT、AST、AKP、TG、血尿素氮及肌酐、尿液總蛋白均高(均P<0.05)，而尿肌酐以及CCr

值均低(均P<0.05)，提示隨著劑量增大，膦甲酸鈉對(duì)肝臟及腎臟的損害越顯著。

綜上所述，連續(xù)使用膦甲酸鈉可損害肝腎功能，對(duì)腎臟的損害更嚴(yán)重，而中、高劑量膦甲酸鈉的作用更為明顯。在臨床應(yīng)用中，需個(gè)體化調(diào)整膦甲酸鈉的給藥劑量和療程，最大限度地保證療效和用藥安全性，減少不良反應(yīng)。