李丹,陳澤斌,殷妮娜,鄭丹,龍漫,謝俊

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標本配穴電針預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷大鼠海馬沉默信息調(diào)節(jié)因子1的影響

李丹,陳澤斌,殷妮娜,鄭丹,龍漫,謝俊

(湖北中醫(yī)藥大學,武漢 430061)

基于沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulation 1, SIRT1)途徑探討標本配穴電針預(yù)處理抗腦缺血再灌注損傷的作用機制。將60只雄性SD大鼠隨機分為A組、B組和C組,每組20只。A組僅分離右側(cè)頸總動脈,不給予其他處理;B組采用改良的MCAO線栓法制備大鼠右側(cè)局灶性腦缺血再灌注損傷模型;C組造模前取百會、腎俞、三陰交行電針預(yù)處理。比較各組再灌注3 h后神經(jīng)行為學評分,并采用TTC染色法測定腦梗死容積百分比,采用HE染色法觀察海馬神經(jīng)元形態(tài),采用Western-blot方法檢測SIRT1和過氧化物酶體增殖物活化受體g共激活因子-1a(peroxisome proliferator-activated receptorgcoactivator-1a, PGC-1a)蛋白表達。C組神經(jīng)行為學評分和腦梗死百分比較B組均顯著降低,SIRT1和PGC-1a蛋白表達較B組均顯著升高,兩組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。標本配穴電針預(yù)處理可能通過上調(diào)內(nèi)源性腦SIRT1和PGC-1a蛋白表達而減輕腦缺血再灌注損傷。

針刺療法;電針;缺血再灌注損傷;沉默信息調(diào)節(jié)因子1;過氧化物酶體增殖物活化受體g共激活因子-1a;大鼠

缺血性腦血管病已逐漸成為我國老年人死亡的首位原因,該類疾病最有效的治療方法是恢復(fù)梗死區(qū)的血流灌注,但由此引發(fā)的再灌注損傷問題也隨之突顯出來。有研究報道,電針預(yù)處理能減輕再灌注損傷[1]。而越來越多的研究表明,沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulation 1, SIRT1)可以參與對抗腦缺血再灌注損傷[2-3],已成為目前研究腦缺血再灌注損傷發(fā)病機制的重要切入點。本實驗基于SIRT1途徑,觀察標本配穴電針預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷模型大鼠海馬組織SIRT1及其下游過氧化物酶體增殖物活化受體g共激活因子-1a(peroxisome proliferator- activated receptorgcoactivator-1a, PGC-1a)蛋白表達的影響,探討其抗腦缺血再灌注損傷的可能分子機制,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠60只,體重為220～240 g,由三峽大學實驗動物中心提供[許可證號SCXK(鄂)2012-0068]。

1.2 主要試劑與儀器

SIRT1抗體、PGC-1a抗體、山羊抗兔抗體[J0314、p038493、S0918,圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司];TTC[A610558-0025,生工生物工程(上海)股份有限公司];SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、蛋白抽提試劑盒(140205、140117,谷歌生物科技有限公司);Bradford蛋白濃度測定試劑盒(140105,碧云天生物技術(shù)研究所)。

3600線栓(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司);臺式高速冷凍離心機[FC5515R,奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司];電泳儀、轉(zhuǎn)移電泳儀槽、垂直電泳槽(北京市六一儀器廠);暗匣(廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司); HANS-200電針治療儀(北京華運安特科技有限責任公司);0.30 mm×25 mm無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

1.3 造模方法

采用2%戊巴比妥鈉溶液(3 mL/kg)腹腔麻醉固定,沿頸部正中剪1個長約2 cm的切口,向右縱行逐層鈍性分離,在近前斜角肌端處游離右側(cè)頸總動脈(common carotid artery, CCA)及其分支頸內(nèi)動脈(internal carotid artery, ICA)和頸外動脈(external carotid artery, ECA),術(shù)中注意保護迷走神經(jīng)。在近CCA分支端3 mm和6 mm處的CCA上分別打1個虛結(jié)和死結(jié),在虛結(jié)和死結(jié)間剪1個約0.2 mm的楔形小口,插入線栓,向下緩慢推進經(jīng)CCA、ICA入顱,線栓黑色標記完全過分叉處且有一定阻力即止。缺血2 h后,再灌注3 h。采用5級4分評分標準對各組大鼠進行神經(jīng)功能評分評估,以大鼠麻醉清醒后神經(jīng)功能障礙1～3分為有效模型[4]。

1.4 動物分組與處理

采用查隨機數(shù)字表法將60只大鼠隨機分為A組、B組和C組,每組20只。

A組僅分離右側(cè)CCA,不給予其他處理。

B組采用上述改良MCAO線栓法缺血2 h后行再灌注3 h,制備大鼠右側(cè)局灶性腦缺血再灌注損傷模型。

C組造模前取百會及雙側(cè)腎俞、三陰交穴進行電針預(yù)處理。穴位定位參照《大鼠穴位圖譜的研制》[5],其中百會位于大鼠頂骨正中,腎俞位于第二腰椎下兩旁,三陰交位于后肢內(nèi)踝尖直上10 mm。采用2%戊巴比妥鈉溶液(3 mL/kg)行腹腔麻醉,選用0.30 mm×25 mm毫針進行針刺,要求百會經(jīng)皮斜刺2 mm,腎俞直刺6 mm,三陰交直刺4～5 mm。同側(cè)腎俞和三陰交接1對電極,百會與輔助電極(于百會前方提捏皮膚淺刺0.5 mm)接1對電極,連接HANS-200電針治療儀,采用疏密波,頻率為2/100 Hz,電流強度為1 mA,通電10 min后留針5 min。連續(xù)重復(fù)操作4次,共計1 h。預(yù)處理結(jié)束后再觀察30 min,然后行造模手術(shù)。

1.5 觀察指標

1.5.1 神經(jīng)行為學評分

再灌注3 h后,參照Longa EZ等[4]的5級4分評分標準對各組大鼠的神經(jīng)行為學進行評分,以評估大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的效果及穩(wěn)定性。0級(0分)為無神經(jīng)功能喪失;1級(1分)為左前肢不能充分伸展;2級(2分)為向左環(huán)行運動,輕度局灶神經(jīng)功能喪失;3級(3分)為向左側(cè)倒,中度局灶神經(jīng)功能喪失;4級(4分)為不能自然行走,重度局灶神經(jīng)功能喪失。

1.5.2 腦梗死容積百分比

各組隨機選取10只大鼠,麻醉后斷頭取全腦,放入-20℃冰箱冷藏15 min后,沿冠狀面切成厚度基本相同的5片,然后立即進行TTC染色,孵育,多聚甲醛固定。分離蒼白區(qū)(梗死區(qū))和非蒼白區(qū)(正常區(qū)),參考相關(guān)文獻[6]的方法,計算腦梗死百分比。腦梗死百分比(%)＝[蒼白區(qū)重量/(蒼白區(qū)重量+非蒼白區(qū)重量)]×100%。

1.5.3 海馬神經(jīng)元形態(tài)

各組隨機選取4只大鼠,麻醉后用4%多聚甲醛灌注固定,石蠟包埋,在海馬齒狀回層面連續(xù)冠狀切片,常規(guī)脫蠟至化。每只大鼠選2張切片做蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色,光鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)。

1.5.4 SIRT1和PGC-1a蛋白表達

各組隨機選取6只大鼠,麻醉后斷頭取全腦,各組取100 mg等量腦組織塊用冷TBS洗滌后于冰上徹底勻漿,將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中振蕩、冰浴30 min,待細胞完全裂解后離心5 min收集總蛋白溶液;采用Bradford方法測定總蛋白,并制作標準曲線測定樣品濃度;各組取40mg總蛋白加入5×蛋白上樣緩沖液進行SDS-PAGE電泳;在預(yù)先甲醇活化的0.45mmPVDF膜上轉(zhuǎn)膜;脫色轉(zhuǎn)好的膜用5%的脫脂牛奶封閉1 h后加入的一抗(稀釋1:500)4℃過夜,洗膜后加入二抗HRP山羊抗兔(稀釋1:3000)室溫孵育30 min脫色洗滌,最后用保鮮膜塑封,X光片夾中曝光,根據(jù)不同的光強度調(diào)整曝光的條件,顯影和定影;以Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學評分比較

由表1可見,A組無神經(jīng)功能喪失,C組神經(jīng)行為學評分與B組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學評分比較 (±s,分)

注:與B組比較1)＜0.01

2.2 各組大鼠腦梗死百分比比較

由圖1、表2可見,A組未見腦梗死灶,B組腦梗死灶明顯,C組腦梗死灶較B組明顯減少。C組腦梗死百分比與B組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。

圖1 各組大鼠腦梗死灶比較

表2 各組大鼠腦梗死百分比比較 (±s,%)

注:與B組比較1)＜0.01

2.3 各組大鼠右側(cè)海馬神經(jīng)元形態(tài)比較

由圖2可見,與A組比較,B組大部分神經(jīng)元腫脹變形,排列紊亂,神經(jīng)元數(shù)量減少,細胞間質(zhì)水腫疏松;與B組比較,C組僅少部分神經(jīng)元腫脹變形,排列尚整齊,細胞間質(zhì)水腫疏松不明顯。

圖2 各組大鼠右側(cè)海馬神經(jīng)元形態(tài)變化(HE染色,×200,n=4)

2.4 各組大鼠SIRT1和PGC-1a蛋白表達比較

由圖3、表3可見,與A組比較,B組海馬SIRT1和PGC-1a蛋白表達明顯減少,兩組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01);與B組比較,C組海馬SIRT1和PGC-1a蛋白表達明顯增多,兩組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。

圖3 各組海馬SIRT1和PGC-1a蛋白成像掃描圖

表3 各組海馬SIRT1和PGC-1a蛋白灰度值比值比較 (±s)

注:與A組比較1)＜0.01;與B組比較2)＜0.01

3 討論

腦缺血再灌注損傷屬中醫(yī)學“中風”范疇,其病機為本虛標實。本實驗采用標本配穴法[7],選取固護先天之元氣的腎俞和后天之胃氣的三陰交為本,選善治腦部疾病的百會為標,3穴配伍旨在扶正祛邪?！把ㄎ会槾填A(yù)處理”是由陳澤斌教授等提出,其目的是通過腧穴鼓舞正氣,加強機體抗邪抗病能力,防止或降低病邪對機體侵害,是針灸“治未病”內(nèi)涵的體現(xiàn)。穴位針刺預(yù)處理能啟動機體內(nèi)源性的自我保護機制,減輕隨后可能發(fā)生的疾病損害[8-11]。從本實驗結(jié)果可以看出,標本配穴電針預(yù)處理能明顯減輕腦缺血再灌注損傷,這與前期標本配穴防治其他疾病[12-15]及針灸“治未病”防治腦缺血再灌注損傷研究結(jié)果相一致[16-19]。

SIRT1是哺乳動物沉默信息調(diào)節(jié)因子家族的重要成員,是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙酰化酶。SIRT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的皮質(zhì)、海馬、小腦和丘腦的神經(jīng)元中廣泛表達[20]。本實驗結(jié)果顯示,A組海馬SIRT1蛋白呈高表達,這與相關(guān)文獻報道一致。最初研究認為SIRT1主要參與延長生物壽命和“限制熱量攝入”相關(guān)的生理過程[21-22]。但新的研究發(fā)現(xiàn),SIRT1能參與抗腦缺血再灌注損傷,SIRT1基因敲除小鼠腦缺血再灌注后的腦梗死面積明顯增大[23]。此外,不同方法預(yù)處理或藥物干預(yù),均可激活SIRT1信號通路抑制由腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元凋亡,進而減輕腦組織損傷以及腦功能障礙,保護腦組織及防止病情進一步惡化[3,24]。本實驗結(jié)果顯示,B組海馬SIRT1蛋白表達較A組顯著減少,提示SIRT1與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)。而C組海馬SIRT1蛋白表達較B組明顯增多,提示標本配穴電針預(yù)處理能激活并上調(diào)SIRT1蛋白表達。

PGC-1a是一種轉(zhuǎn)錄共活化因子,既能增加線粒體生物合成,還可促進線粒體氧化表達。PGC-1a位于SIRT1的下游區(qū),SIRT1通過直接去乙酰化增加PGC-1a活性[25-27],SIRT1/PGC-1a在抗腦缺血再灌注損傷中起著重要作用[28]。本實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn),不同組別間大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)SIRT1和PGC-1a蛋白表達趨勢的一致性。因此推測,標本配穴電針預(yù)處理能減輕缺血再灌注的作用可能與其上調(diào)內(nèi)源性SIRT1表達,進而去乙?；饔迷鰪奝GC-1a表達有關(guān)。

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Effect of Electroacupuncture Pretreatment with Secondary-primary Point Combination on Hippocampal SIRT1 in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

,-,-,,,.

,430061,

To explore the action mechanism of electroacupuncture pretreatment with secondary-primary point combination against cerebral ischemia-reperfusion injury by focusing the silent information regulator 1 (SIRT1) pathway.Sixty male Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into group A, group B and group C, with 20 rats in each group. Group A only received right common carotid artery separation without any other treatments, while group B was intervened by the modified middle cerebral artery occlusion (MCAO) method to establish the right focal cerebral ischemia-reperfusion injury model, and group C was intervened by electroacupuncture pretreatment at Baihui (GV20), Shenshu (BL23) and Sanyinjiao (SP6) before modeling. Neurobehavioral scores in the three groups were compared three hours after the reperfusion. The percentage of cerebral infarct volume was measured by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)staining. The morphology of hippocampal neurons was observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. The protein expressions of SIRT1 and peroxisome proliferator-activated receptorgcoactivator-1a(PGC-1a) were examined using Western blotting method.Compared to group B, the neurobehavioral score and the percentage of cerebral infarct volume declined significantly in group C, the protein expressions of SIRT1 and PGC-1aboth increased significantly in group C,and the between-group differences were statistically significant (＜0.05).Electroacupuncture pretreatment with secondary-primary point combination may alleviate cerebral ischemia-reperfusion injury by upregulating the protein expressions of endogenous SIRT1 and PGC-1ain brain.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Ischemia-reperfusion injury; Silent information regulation 1; Peroxisome proliferator-activated receptorgcoactivator-1a; Rats

1005-0957(2019)13-0050-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.13.0050

2018-11-03

湖北省教育廳科研指導(dǎo)性項目(B2017101)

李丹(1988—),女,實驗師,博士,Email:648781117@qq.com

謝俊(1980—),女,講師,Email:466083551@qq.com