鄭俊俊，毛玉娣，汪朝靚，殷 實，王 華

在全球癌癥相關(guān)死亡原因中，結(jié)腸癌排第四位[1]，結(jié)腸癌形成是一個復(fù)雜緩慢的過程，甚至可達20年之久。隨著早期診斷技術(shù)不斷發(fā)展，在過去的20年中，雖然結(jié)腸癌的死亡率已明顯下降，但是發(fā)生率仍居高不下[2]，并且缺乏新的治療手段。研究[3-4]表明，20%～30%的結(jié)腸癌患者具有遺傳突變，其中基因APC和TP53在癌前病變或腺瘤的形成中發(fā)揮著重要作用，而非編碼基因目前在人類疾病與腫瘤中的作用受到廣泛關(guān)注，其中微小RNA(microRNA，miRNA)或其涉及的信號通路，可為結(jié)腸癌的診治和預(yù)防提供新的靶點和策略。miRNA是指長度為21～23個核苷酸的內(nèi)生性非編碼小分子單鏈RNA，主要通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)后水平調(diào)節(jié)基因的表達，在生理病理學過程中發(fā)揮著廣泛的作用[5]。該文應(yīng)用高通量基因芯片技術(shù)，研究結(jié)腸癌中miRNA表達譜的變化，并且通過生物信息學分析基因間的相互作用及所涉及的生物過程和信號通路。

1 材料與方法

1.1病例資料臨床標本均來自安徽醫(yī)科大學附屬安徽省立醫(yī)院內(nèi)鏡中心，所有患者簽署知情同意書，項目實施由安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院倫理委員會批準。包括5例結(jié)腸癌組織和5例癌旁正常組織，癌旁組織選取距腫瘤邊緣至少大于5 cm，并且無腫瘤細胞浸潤，標本的診斷均符合病理學診斷標準，每對結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織來源同一名患者。臨床標本的采集來自于47～73(61±12.1)歲的男性患者，所有的結(jié)腸癌患者為初診未接受任何治療包括手術(shù)及放化療。電子結(jié)腸鏡下夾取標本后立即放入RNA later溶液(美國Thermo Fisher公司)中，防止RNA降解，4 ℃過夜，-20 ℃過度后儲存于-80 ℃冰箱中。

1.2總RNA的提取臨床標本中總RNA的提取使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)，對總RNA使用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit(AM1561，美國ABI公司)進行純化。瓊脂糖凝膠電泳用來檢測RNA完整性。分光光度法(Nanodrop 2000，Thermo Scientific公司)用來檢測RNA的純度與總量，要求A260/280≥1.80并且總量≥1 μg。

1.3使用基因芯片檢測基因表達的變化提取的總RNA先孵育加尾，然后使用FlashTag標記試劑盒(美國Genisphere 公司)進行生物素標記miRNA，與 Affymetrix miRNA4.0芯片進行雜交，然后進行基因芯片清洗染色和掃描，最后使用AGCC軟件(affymetrix? geneChip? command console? software)將芯片的熒光掃描圖像保存成.DAT文件以待分析。此步由北京博奧生物有限公司輔助完成。

1.4靶基因的預(yù)測miRNA靶基因預(yù)測基于miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) 網(wǎng)站，此網(wǎng)站給出了12種miRNA靶基因預(yù)測程序的預(yù)測結(jié)果，程序分別為miRWalk、miRDB4.0、DIANA-microTv4.0、miRanda-rel2010、mirBridge、 miRmap、miRNAMap、PicTar2、PITA、RNA22v2、RNAhybrid2.1和Targetscan6.2。結(jié)果選擇至少被6種軟件預(yù)測到的基因。

1.5GO富集和KEGG信號通路分析GO(gene ontology)富集分析可以整合生物信息學數(shù)據(jù)庫中大量的資源，主要包括生物過程、分子功能、細胞組分三個獨立的體系。KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes) 信號通路和GO分析用來探索靶基因參與的生物學過程和涉及的信號通路。Cytoscape V3.2.1軟件用來解讀差異性基因相關(guān)的信號通路及功能，顯著性的檢驗水準為α=0.05。

1.6統(tǒng)計學處理Agilent Feature Extraction軟件用于處理基因芯片掃描圖得到原始數(shù)據(jù)，GeneSpring 軟件將原始數(shù)據(jù)進行歸一化分析并以Excel格式輸出數(shù)據(jù)。利用SAM(significance analysis of microarray)R程序包分析差異基因，差異基因的篩選標準是：P<0.05 且變化倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)≥2或≤0.5；GraphPad Prism 6 軟件用于圖形展示。

2 結(jié)果

2.1結(jié)腸癌中miRNA表達譜的變化本研究收集了5例結(jié)腸癌組織和5例癌旁正常結(jié)腸組織使用高通量基因芯片技術(shù)進行基因檢測。結(jié)果顯示，與正常癌旁組織相比，在結(jié)腸癌組織中高表達的miRNA有22個；相反，在結(jié)腸癌組織中低表達的miRNA有51個(篩選標準：FC>2且校正后P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義)。同時，火山圖和散點圖可更加清析直觀的顯示差異性表達的miRNA的數(shù)量，見圖1。散點圖直觀顯示差異性表達的miRNA的數(shù)量；火山圖以FC的log2為橫軸，以校正后P值 的lg值負數(shù)為縱軸，分析全部檢測miRNA的差異。兩圖中紅色標記的miRNA有22個，表示在結(jié)腸癌中上調(diào)。綠色標記的miRNA有51個，表示在結(jié)腸癌下調(diào)。黑色標記的miRNA表示變化無統(tǒng)計學意義。

2.2結(jié)腸癌組織中變化最顯著的miRNA通過Affymetrix miRNA4.0芯片篩選，在結(jié)腸癌組織中異常表達的miRNA共有73個，其中變化最為顯著的miRNA，如在結(jié)腸癌組織高表達的hsa-miR-183-5p、hsa-miR-1247-5p、hsa-miR-552-3p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-183-3p、hsa-miR-182-5p等，結(jié)腸癌組織低表達的如hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-1、hsa-miR-143-5p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-mir-139等，部分miRNA的表達信息見表1。此外，為了整體展示miRNA基因表達譜的變化，Circos圖以基因位置為基礎(chǔ)展示差異基因的差異程度，見圖2，圖中紅色表示上調(diào)差異基因，綠色表示下調(diào)差異基因，圖中柱的長度表示差異基因的倍數(shù)，柱越長表示差異倍數(shù)越大。

圖1 全部檢測基因散點圖和火山圖差異比較

2.3靶基因預(yù)測分析基于miRWalk2.0網(wǎng)站，本次研究對差異性表達的miRNA進行靶基因預(yù)測分析。結(jié)果表明，篩選出的miRNAs可調(diào)節(jié)多種結(jié)腸癌相關(guān)基因，如miR-622可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、TP53、KARS、WNT、SMAD4等靶基因的表達，miR-125b-5p可調(diào)節(jié)信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activators of transcription 3，STAT3)、TP53、APC的表達；而APC同時是miR-125b-5p、miR-30a-5p、miR-149-5p、 miR-18a-5p、 miR-182-5p、miR-422a的靶基因，同樣，WNT2/3受miR -1、miR-183-5p、 miR -7-5p的共同調(diào)節(jié)。所以，異常表達的miRNA與靶基因組成基因網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3，展示了部分異常表達miRNA與靶基因的關(guān)系。

2.4靶基因GO富集分析本次研究對這些基因進行了GO富集分析，GO富集分析是生物信息學研究中非常重要的工具。以P<0.001為檢驗標準，本研究共篩選出817個富集的生物過程及每個生物過程中所包含的差異性表達的基因。其中前30個富集的生物學過程包括細胞通訊調(diào)控、生物過程的正向調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)修飾過程、高分子代謝過程的調(diào)控、結(jié)構(gòu)形態(tài)改變等生物學過程。見圖4。直觀的顯示靶基因與富集的生物過程的關(guān)聯(lián)程度。

表1 結(jié)腸癌中異常表達的miRNA

2.5靶基因涉及的KEGG信號通路分析本次研究對靶基因進行了KEGG信號通路分析。結(jié)果顯示，在KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫中，共篩選出127條信號通路(以P<0.05為檢驗標準)，如Wnt信號通路、癌癥相關(guān)KEGG通路、翻譯后蛋白質(zhì)修飾、FGFR信號通路、RAS信號通路、ERBB4信號轉(zhuǎn)導、TP53轉(zhuǎn)錄調(diào)控、PI3K-Akt信號通路、Hippo通路等。 Pathway富集分析氣泡圖見圖5(圖中所示氣泡大小表示靶基因注釋到此功能條目的基因數(shù)目，顏色對應(yīng)富集分析結(jié)果中P值)。Top圖見圖6，總結(jié)了前30個差異性最為顯著的信號通路。

圖2 Circos圖

圖3 miRNA與靶基因網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 GO分析顯示差異性表達的基因富集最顯著的前30個生物過程

圖5 Pathway富集分析氣泡圖

圖6 靶基因富集最明顯的30條信號通路

3 討論

在我國，結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年增加。2015年，我國結(jié)腸癌發(fā)病率由70年代的12/10萬上升到56/10萬，年均增長率為4.2%，明顯高于國際水平。結(jié)腸癌通常需手術(shù)切除腫瘤組織、化療和靶向治療，目前新的靶向藥物主要是針對腫瘤血管生成的內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)或表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)等[6]，但效果欠佳，約40%的病例對EGFR抑制劑產(chǎn)生耐藥[7]，故尋找新的治療靶點至關(guān)重要。

結(jié)腸癌的發(fā)生與KRAS、BRAF、TP53、APC等基因突變有重要的關(guān)系。近年來，miRNA與結(jié)腸癌常見突變基因的相互作用備受關(guān)注，并且在結(jié)腸的發(fā)生發(fā)展過程、臨床特征以及耐藥等方面中發(fā)揮重要作用。例如，在結(jié)腸癌組織中高表達的hsa-miR-183-5p和低表達的hsa-miR-125b-5p[8-9]等。本研究共篩選出73個差異性表達的miRNA并對其進行總結(jié)。其中具有抑癌作用的miR-1已被證明參與到多種腫瘤中[10]，本研究表明其在結(jié)腸癌組織中低表達，靶基因預(yù)測結(jié)果顯示其可調(diào)節(jié)WNT3以及KRAS基因，后兩者被證明可與miRNA相互作用參與結(jié)腸癌的發(fā)生[11]。這些基因在結(jié)腸癌中的表達情況與本研究基因芯片檢測的結(jié)果一致，說明它們在結(jié)腸癌的生物學過程中發(fā)揮重要作用。

此外，本次研究仍發(fā)現(xiàn)了一些在結(jié)腸癌中未見報道的miRNA基因。基因芯片結(jié)果顯示在結(jié)腸癌組織中高表達的hsa-miR-183-3p、hsa-miR-224-5p均未見有關(guān)報道，在結(jié)腸癌組織中低表達的miR-99a-5p在其他腫瘤中的作用已被報道[12]，并且可作為胃癌生物學標志物[13]，但在結(jié)腸癌中尚未見報道，本研究靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)其可能是通過調(diào)控發(fā)揮抑癌作用。這些腫瘤相關(guān)基因為結(jié)腸癌的發(fā)病分子機制的研究指出新的方向。

miRNA通過調(diào)控編碼基因的表達發(fā)揮作用，故對差異性表達的miRNA進行靶基因預(yù)測至關(guān)重要。結(jié)果顯示差異性表達的miRNA可調(diào)控多種與結(jié)腸癌相關(guān)的蛋白編碼基因。例如，Wnt信號轉(zhuǎn)導失調(diào)和APC基因突變失活是大腸癌最常見的分子機制，約發(fā)生在75%的大腸癌中[14]，靶基因分析顯示miR-1、-125b-5p、-30a-5p、-7-5p、-183-5p以APC或WNT為作用靶點。此外多項報道表明在結(jié)腸癌TGF-β和促癌基因(proto-oncogene，MYC)可與miRNA相互作用[15]，本研究顯示miR-622可同時調(diào)控TGF-β、MYC基因，這值得引起關(guān)注。

另外，本研究針對靶基因所表示的生理意義進行了生物信息學分析。許多miRNA充當Wnt通路的調(diào)節(jié)因子在信號級聯(lián)的多個水平上對其進行調(diào)控，如miR-34a/b/c 可直接作用和抑制Wnt信號通路的效應(yīng)分子，包括WNT1、WNT3、LRP6、β-catenin等，從而抑制WNT信號通路。本研究提供了在結(jié)腸癌中宏觀miRNA表達譜的變化，將為今后的研究提供重要的參考依據(jù)。并且這些差異性表達的miRNA可能與結(jié)腸癌的發(fā)病機制和臨床特征相關(guān)，但是仍然需要更多的樣本和實驗進一步驗證。

總之，本次研究在結(jié)腸癌篩選出73個差異性表達的miRNA，并描述了其所調(diào)控的靶基因、富集的生物過程和信號通路。這將對探討結(jié)腸癌發(fā)病機制，尋找早期診斷和預(yù)后標志物，擴展治療策略提供新的視野。