王 杰，李婷婷，李瑞紅，陳志強(qiáng)，周元園，王韞芳，柳 娟，張宏艷

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤，在發(fā)達(dá)城市地區(qū)，其發(fā)病率逐年升高，據(jù)國家癌癥中心最新統(tǒng)計顯示，全國每年新發(fā)乳腺癌例數(shù)超過27萬，死亡例數(shù)超過7萬，位居女性惡性腫瘤發(fā)病率之首。其中，三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)的雌激素受體(estrogen receptor，ER)，孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)均為陰性，具有惡性程度高、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、生存率低的特點(diǎn)[1]。三陰性乳腺癌因其特殊生物學(xué)特征，易產(chǎn)生耐藥導(dǎo)致預(yù)后較差，因此研發(fā)能降低腫瘤耐藥性和預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的更為高效的抗腫瘤藥物就變得尤為重要。

通過組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，組織化培養(yǎng)的的腫瘤微組織已經(jīng)被用于腫瘤生物學(xué)及分子機(jī)制研究，相較于二維(two dimensional，2D)培養(yǎng)，三維(three dimensional，3D)培養(yǎng)模型可以模擬腫瘤細(xì)胞在體生長狀態(tài)，并取得了大量的研究進(jìn)展[2-3]。3D細(xì)胞培養(yǎng)支架為細(xì)胞培養(yǎng)提供了類似體內(nèi)生長環(huán)境，因此選擇好的3D細(xì)胞培養(yǎng)支架材料也是成功進(jìn)行3D培養(yǎng)的一個關(guān)鍵因素[4]?；|(zhì)膠(Matrigel)是一種孔徑為20～50 nm的水凝膠基質(zhì)，其主要成分為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白[5]。MDA-MB-231是一種ER、PR、HER-2均為陰性的乳腺癌細(xì)胞系，惡性程度高。該研究擬采用 Matrigel模擬腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境，促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞形成3D類組織結(jié)構(gòu)，采用液滴重疊法構(gòu)建體外腫瘤細(xì)胞3D培養(yǎng)體系，對臨床常用抗腫瘤藥物進(jìn)行藥物藥效學(xué)評價，旨在構(gòu)建一種能夠真實(shí)模擬反映體內(nèi)抗腫瘤藥物敏感性的基于Matrigel的3D腫瘤微組織培養(yǎng)模型(3D-M)；使用流式細(xì)胞儀在2D、3D及3D-M培養(yǎng)條件下腫瘤細(xì)胞對藥物的內(nèi)吞情況，探索不同模型所檢測的藥物敏感性差異的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥物、試劑與儀器多西紫杉醇注射液(docetaxel injection，DTX，英國安萬特醫(yī)藥有限公司)；鹽酸表柔比星注射液(epirubicin hydrochloride for injection，EPI，海正輝瑞制藥有限公司)；酒石酸長春瑞濱注射液(vinorelbine bitartrate injection，NVB，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)；氟尿嘧啶注射液(fluorouracil injection，5-Fu，天津金耀藥業(yè))；注射用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide for injection，CTX，百特國際有限公司)；順鉑注射液(cisplatin injection，DDP，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)；注射用鹽酸吉西他濱(gemcitabine hydrochloride for injection，GEM，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)；紫杉醇注射液(paclitaxel injection，Tax，?？谄媪χ扑幱邢薰?；依托泊苷注射液(etoposide injection，VP-16，齊魯制藥有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清 (以色列bioligical industries公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)；Alamar Blue(美國Invitrogen 公司)；96孔板(美國Costar公司)；Attune NxT流式細(xì)胞儀、CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；Vectra熒光顯微鏡、Ensight微孔板檢測儀(美國PerkinElmer 公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清、100 μg/ml 青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待其匯合度達(dá)到90% 左右，用含0.02% EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.23D與3D-M腫瘤微組織的構(gòu)建 將Matrigel基質(zhì)膠用4 ℃ DMEM培養(yǎng)基稀釋成10 μg/ml，低吸附的96孔U型孔板每孔50 μl包被，靜置10 min 左右，將50 μl MDA-MB-231細(xì)胞懸液分別以50、100、200、400、600、800、1 200、1 600、2 000個/孔加入孔板混合均勻，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，期間鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照記錄3D微組織的變化。確定MDA-MB-231腫瘤微組織構(gòu)建的最適細(xì)胞數(shù)，將MDA-MB-231以最適細(xì)胞數(shù)接種于無Matrigel包被的低吸附的96孔U型孔板中，并定期觀察。將MDA-MB-231細(xì)胞在3D、3D-M條件下培養(yǎng)5 d的腫瘤微組織，收集后4%多聚甲醛固定，依次經(jīng)70%酒精20 min，95%酒精20 min，100%酒精2×20 min，二甲苯2×20 min梯度脫水；石蠟包埋切片，脫蠟后經(jīng)蒸餾水洗3次，Harris蘇木精-酸化伊紅染色，再經(jīng)脫水透明后封片拍照。

1.2.3Alamar blue法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞接種，2D培養(yǎng)的細(xì)胞以3×103個/孔接種于96孔板中，3D及3D-M培養(yǎng)的細(xì)胞以600個/孔分別接種于無基質(zhì)培養(yǎng)基和Matrigel(10 μg/ml)包被的低吸附的96孔板培養(yǎng)，在0、1、2、3、4、5 d時分別檢測12個孔，每孔加入10 μl的Alamar blue試劑，混勻后置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱2 h，Ensight微孔板檢測儀檢測Ex 570 nm、Em 585 nm的熒光值，用于評測細(xì)胞活性。

1.2.4抗腫瘤藥物活性檢測 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞接種，2D培養(yǎng)的細(xì)胞以8×103個/孔接種于96孔中，24 h過夜貼壁后加化療藥進(jìn)行細(xì)胞毒性測試。3D及3D-M培養(yǎng)的細(xì)胞以600個/孔分別接種于無基質(zhì)和10 μg/ml Matrigel包被的低吸附的96孔板培養(yǎng)，5 d后加化療藥進(jìn)行細(xì)胞毒性測試，DTX、EPI、NVB、5-Fu、DDP、Tax、VP-16濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μg/ml，CTX、GEM濃度分別為0.1、1、10、100、1 000 μg/ml。2D、3D及3D-M培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞在給藥24 h后，每孔分別加入10 μl 的Alamar blue試劑，混勻后置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱2 h，Ensight微孔板檢測儀檢測Ex 570 nm、Em 585 nm的熒光值，用于評測細(xì)胞活性。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測化療藥物進(jìn)入腫瘤微組織的情況 將MDA-MB-231細(xì)胞在2D、3D及3D-M 條件下培養(yǎng)5 d，棄培養(yǎng)基，各加入含有10 μg/ml EPI的DMEM培養(yǎng)基，加藥作用時間為0、10、30、60 min時，棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS洗3遍，將2D、3D和3D-M培養(yǎng)的細(xì)胞消化為細(xì)胞懸液分別收集于1.5 ml離心管中，使用流式細(xì)胞儀檢測MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)吞EPI的量。

2 結(jié)果

2.13D培養(yǎng)乳腺癌微組織的形態(tài)表征鏡下觀察表明Matrigel可以促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞成球，細(xì)胞數(shù)偏低和偏高均不能和基質(zhì)相契合，僅在400～800 個細(xì)胞/孔時，MDA-MB-231細(xì)胞可以和Matrigel充分結(jié)合，形成致密立體結(jié)構(gòu)，故確定以MDA-MB-231細(xì)胞(600/孔)與50 μl Matrigel(10 μg/ml)共培養(yǎng)時可以形成3D微組織，見圖1。在2D單層培養(yǎng)條件下，鏡下乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞貼壁生長，癌細(xì)胞大小不等成巢狀匯集，癌細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形、梭形、橢圓形。在用低吸附U型底96孔板3D培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞時，加Matrigel共培養(yǎng)時可以聚集成緊密的球形，而未加Matrigel培養(yǎng)的微組織鏡下較為松散。在3D和3D-M培養(yǎng)的腫瘤微組織石蠟切片HE染色時，3D培養(yǎng)的微組織細(xì)胞呈現(xiàn)類圓形，3D-M共培養(yǎng)的腫瘤微組織更為緊密，見圖2。

2.2MDA-MB-231細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下增殖情況比較將MDA-MB-231細(xì)胞在2D、3D和3D-M培養(yǎng)條件下1～5 d的細(xì)胞計數(shù)做增殖曲線時，可以發(fā)現(xiàn)2D培養(yǎng)較3D培養(yǎng)增殖快，呈指數(shù)型增長；3D培養(yǎng)時生長速度較慢，加Matrigel時細(xì)胞增殖較不加Matrigel時快，表明Matrigel能夠促進(jìn)MDA-MB-231的細(xì)胞增殖，見圖3。

圖1 MDA-MB-231細(xì)胞三維培養(yǎng)的形態(tài)表征

圖2 MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)條件下的生長情況及染色

2.3使用不同培養(yǎng)條件下的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤藥物活性檢測結(jié)果MDA-MB-231細(xì)胞在2D、3D和3D-M培養(yǎng)條件下，使用臨床常用一線化療藥物DTX、EPI、NVB、5-Fu、CTX、GEM、DDP、Tax、VP-16，在多濃度條件下分別做藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，通過比較藥物20%抑制濃度(IC20)值，3D培養(yǎng)條件下的IC20值大于2D培養(yǎng)，3D-M培養(yǎng)條件下的IC20值大于3D培養(yǎng)，測試DTX、EPI、NVB、5-Fu、CTX、GEM、DDP、Tax、VP-16的 IC20，3D分別為2D的11.7、2.3、46.5、12.7、769.2、8.1、1.7、11.7、0.7倍；3D-M分別為3D的4.4、7.6、1.9、1.6、1、1.4、416.7、0.8、5.9倍，可以發(fā)現(xiàn)3D-M培養(yǎng)條件下的細(xì)胞對化療藥物毒性反應(yīng)的敏感性較差，耐受性高，反映出較強(qiáng)的耐藥性，見表1、圖4。

圖3 MDA-MB-231細(xì)胞在2D、3D和3D-M 培養(yǎng)條件下

表1 MDA-MB-231細(xì)胞體外24 h藥物毒性

2.4藥物在不同培養(yǎng)條件下的MDA-MB-231細(xì)胞的含量分析EPI是一個帶自發(fā)熒光的臨床一線化療藥，能夠在488 nm的激發(fā)光下，發(fā)射紅色熒光。通過觀察MDA-MB-231細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下不同作用時間時對EPI的內(nèi)吞，可以直觀地比較MDA-MB-231細(xì)胞中藥物含量的變化。在流式細(xì)胞儀檢測MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)吞EPI實(shí)驗(yàn)中，藥物作用時間分別為0、10、30、60 min，作用時間越長，內(nèi)吞藥物的MDA-MB-231細(xì)胞的陽性細(xì)胞率越高，中位熒光強(qiáng)度越強(qiáng)；3D培養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)吞藥物的陽性細(xì)胞率和中位熒光強(qiáng)度較2D培養(yǎng)低，3D-M相較3D培養(yǎng)條件下的陽性細(xì)胞率和中位熒光強(qiáng)度偏低，在藥物作用10 min時，3D-M的陽性細(xì)胞率和中位熒光強(qiáng)度較低，分別為3D的71%和54%，30 min時，3D-M的陽性細(xì)胞率和中位熒光強(qiáng)度較低，分別為3D的80%和25%，60 min時，3D-M的陽性細(xì)胞率和中位熒光強(qiáng)度較低，分別為3D的93%和27%，見圖5。

3 討論

傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)法多采用2D單層平面培養(yǎng)，實(shí)際上許多細(xì)胞從組織中分離并進(jìn)行2D培養(yǎng)后，會貼壁生長逐漸失去極性，導(dǎo)致異常分化甚至失去分化表型[6]。2D培養(yǎng)的MDA- MB-231細(xì)胞生長速度較快，培養(yǎng)箱過夜24 h內(nèi)便可以貼壁，生長2～3 d細(xì)胞匯合度便可達(dá)到80%以上。其無論以何種細(xì)胞密度進(jìn)行無基質(zhì)介導(dǎo)的3D培養(yǎng)，自身均難以進(jìn)行微組織化培養(yǎng)。MDA-MB-231細(xì)胞600/孔和50 μl 的Matrigel(10 μg/ml)在U型低吸附96孔板共培養(yǎng)5 d可以形成3D腫瘤微組織。3D培養(yǎng)條件下，腫瘤細(xì)胞的增殖速率較2D減慢，細(xì)胞生長周期延長，可以進(jìn)行長時間、動態(tài)的細(xì)胞觀察和檢測。

2D細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)在研究腫瘤細(xì)胞生物學(xué)的主要方法，但在2D培養(yǎng)體系下建立的2D細(xì)胞培養(yǎng)體外模型，不能很好地模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境之間的相互作用，研究的耐藥機(jī)制也不能完全說明體內(nèi)實(shí)際的耐藥機(jī)制[7]。與傳統(tǒng)2D培養(yǎng)相比，3D細(xì)胞培養(yǎng)既可模擬體內(nèi)細(xì)胞生長的微環(huán)境，又有更直觀性和條件可控的優(yōu)勢。David et al[8]在對2D和3D培養(yǎng)條件下的肺癌細(xì)胞研究時發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞2D培養(yǎng)時細(xì)胞間相互作用較難實(shí)現(xiàn)，而3D培養(yǎng)的細(xì)胞間緊密連接，更利于傳遞生物信息，更接近體內(nèi)細(xì)胞的分化程度、超微結(jié)構(gòu)等生物特征。

以往研究表明，3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)能更好的模擬在人體內(nèi)細(xì)胞的生長微環(huán)境。3D培養(yǎng)的體外腫瘤微組織細(xì)胞具有與體內(nèi)腫瘤細(xì)胞相似的耐藥性，但當(dāng)腫瘤微組織被消化為單細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞對藥物的耐受性大幅降低。Graham et al[9]研究證實(shí)乳腺癌細(xì)胞EMT6經(jīng)過3D培養(yǎng)后具有耐藥性，但改為2D培養(yǎng)后其藥物耐受性顯著降低。Matrigel是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的提取物，可以為細(xì)胞提供物理支撐，還能使細(xì)胞快速黏附，并充分接觸到細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞提供近似于體內(nèi)的立體微環(huán)境[10]。Matrigel可以為MDA-MB-231細(xì)胞構(gòu)建一個生長的微環(huán)境，并可以促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，能夠真實(shí)模擬腫瘤細(xì)胞體內(nèi)的生長狀態(tài)。Wang et al[11]在 Matrigel中培養(yǎng)人乳腺上皮細(xì)胞(MCF10 A)以及成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等乳腺間充質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)過3D培養(yǎng)，促使組織形成類似體內(nèi)的乳腺腺泡狀結(jié)構(gòu)，乳腺間充質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出與體內(nèi)相似的生物學(xué)特性，如極性的維持及上皮細(xì)胞功能性分化等，說明3D培養(yǎng)比2D培養(yǎng)更能模擬體內(nèi)微環(huán)境。大量研究[12-13]也表明，3D培養(yǎng)模型優(yōu)于2D細(xì)胞培養(yǎng)模型。

圖4 MDA-MB-231細(xì)胞在2D、3D和3D-M培養(yǎng)條件下的抗腫瘤藥物活性檢測

圖5 流式細(xì)胞儀檢測化療藥物進(jìn)入不同培養(yǎng)條件下腫瘤微組織的情況

據(jù)文獻(xiàn)報道，TC-71 EW腫瘤細(xì)胞經(jīng)3D支架培養(yǎng)后，對阿霉素有較強(qiáng)的耐藥性，其IC50為2.738 mmol/L，而經(jīng)2D貼壁單層培養(yǎng)的 TC-71 EW腫瘤細(xì)胞對阿霉素的敏感性顯著增高，其IC50為0.012 2 mmol/L[14]。本研究采用 Alamar blue法進(jìn)行乳腺癌細(xì)胞藥物敏感性檢測，通過比較多種藥物IC20值，3D培養(yǎng)條件下的IC20值遠(yuǎn)大于2D培養(yǎng)，3D-M培養(yǎng)條件下的IC20值遠(yuǎn)大于3D培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可以發(fā)現(xiàn)在3D-M培養(yǎng)條件下的細(xì)胞對化療藥物毒性反應(yīng)的敏感性較差，表明3D-M條件下培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物有較強(qiáng)的耐受性。Matrigel 3D培養(yǎng)時MDA-MB-231細(xì)胞可形成致密的立體球形結(jié)構(gòu)，在進(jìn)行測試抗腫瘤藥物活性時，2D培養(yǎng)的細(xì)胞可以和藥物充分接觸，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度較高，藥物更容易起效；Matrigel 3D細(xì)胞球能夠模擬實(shí)體瘤獨(dú)特的ECM微環(huán)境，降低藥物擴(kuò)散速度，細(xì)胞間相互作用增強(qiáng)，所形成的致密結(jié)構(gòu)使藥物不能大量進(jìn)入球體內(nèi)部，導(dǎo)致3D腫瘤微組織總體內(nèi)吞藥物較2D培養(yǎng)少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，因此3D培養(yǎng)時IC20值遠(yuǎn)大于2D培養(yǎng)，此時腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了耐藥性。蔣喬 等[15]在構(gòu)建腫瘤微組織細(xì)胞球的模型時，也發(fā)現(xiàn)致密結(jié)構(gòu)可以降低藥物擴(kuò)散，促進(jìn)細(xì)胞存活產(chǎn)生耐藥。

綜上所述，基于Matrigel和乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)體外模型，可真實(shí)模擬腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長，可作為抗腫瘤藥物體外篩藥模型，為藥物研發(fā)和臨床用藥提供理論指導(dǎo)。使用Matrigel 3D培養(yǎng)MDA-MB-231體外腫瘤微組織模型，也可以為體外乳腺癌耐藥性研究和信號通路機(jī)制研究提供研究模型。

(致謝：感謝劉端祺教授在論文的撰寫與修改方面提出的寶貴建議。)