丁西平，毛玉娣，汪朝靚，周 歡，程 前

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。早期胃癌無明顯的癥狀和體征，極大限制了早期的診斷率，并且錯過了治療的最佳時期，因此，目前胃癌的5年生存率仍然不令人滿意[2]。胃癌在病理特征上常繼發(fā)于慢性萎縮性胃炎和異型增生，其中包含眾多遺傳與表觀遺傳的改變，基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜多元。例如，以往的研究[3]證明多種促炎基因之間相互作用參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。為了提高胃癌早期診斷率，尋找新的臨床標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，該文應(yīng)用高通量基因芯片技術(shù)，研究胃萎縮性炎惡變過程基因表達(dá)譜的變化，并且通過生物信息學(xué)分析基因間的相互作用及所涉及的生物過程和信號通路。

1 材料與方法

1.1病例資料臨床標(biāo)本的收集由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。所有標(biāo)本均來自中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)內(nèi)鏡中心，包括5例慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生組織和5例進(jìn)展期胃癌組織，并符合病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。兩組臨床標(biāo)本均來自于男性患者，年齡分別為42～64(55±10.03)歲和45～65(57±9.14)歲(P=0.77)。所有胃癌患者均未接受任何治療包括手術(shù)、化療、放療以及生物治療等。內(nèi)鏡下夾取的標(biāo)本立即放入RNA later(美國Thermo Fisher公司)溶液中穩(wěn)定RNA，防止降解，然后儲存于-80 ℃冰箱中。

1.2RNA提取與定量TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)用來提取各臨床標(biāo)本中總RNA，并進(jìn)一步采用 NucleoSpin? RNA clean-up試劑盒(740.948.250)對總RNA進(jìn)行過柱純化。使用分光光度法(Nanodrop 2000，美國Thermo Scientific公司)檢測RNA的純度與總量，合格標(biāo)準(zhǔn)為吸光度A260/280≥1.80且RNA總量≥1 μg。瓊脂糖凝膠電泳用來檢測RNA完整性。

1.3基因芯片檢測提取各組織中的總RNA先合成cDNA，并在體外轉(zhuǎn)錄成cRNA，既而反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 經(jīng)Nucleospin? Extract Ⅱ試劑盒(MN公司，Cat.No.740609.250)純化后使用紫外分光光度計定量，然后經(jīng)熒光染料標(biāo)記后與 mRNA 表達(dá)譜芯片V4.0(GeeDom)進(jìn)行雜交?；蛐酒s交、清洗和掃描由北京博奧生物有限公司完成。

1.4GO富集和KEGG信號通路分析GO(Gene Ontology)富集分析包括細(xì)胞組分、分子功能和生物過程三個獨(dú)立的分析體系，可以整合生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫中的資源。 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 信號通路和GO分析用來探索差異性表達(dá)的基因參與的信號通路及生物過程。Cytoscape V3.2.1軟件用來解讀差異性基因相關(guān)的信號通路及功能，顯著性的檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

1.5PPI(Protein-ProteinInteraction)網(wǎng)絡(luò)分析STRING數(shù)據(jù)庫是檢索基因間相互作用的搜索工具，可以提供實(shí)驗(yàn)性和預(yù)測性的基因之間的相互作用和聯(lián)系。STRING 10.0版本用于繪制和分析差異性表達(dá)基因間的相互作用。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理Agilent Feature Extraction軟件用于處理基因芯片掃描圖并得到原始數(shù)據(jù)，GeneSpring 軟件將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化分析并以Excel格式輸出數(shù)據(jù)。通過SPSS 17.0軟件進(jìn)行雙樣本T檢驗(yàn)，差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為Fold Change(FC，變化倍數(shù))≥2.0且P<0.05；Cluster 3.0軟件用于聚類分析，GraphPad Prism 6軟件用于圖形展示。

2 結(jié)果

2.1胃萎縮性炎癥惡變過程中基因表達(dá)譜的變化為了全面分析胃萎縮性炎惡變至胃癌過程中基因表達(dá)譜的變化，本研究收集了5例慢性重度萎縮胃炎伴腸上皮化生組織和5例進(jìn)展期胃癌組織進(jìn)行高通量基因芯片檢測。轉(zhuǎn)錄組基因芯片分析技術(shù)顯示了萎縮性胃炎組織及胃癌組織中基因表達(dá)譜的變化， 共2 779個具有明確注釋的基因差異性表達(dá)(FC>2且校正后P<0.05認(rèn)為是具有顯著差異性表達(dá))，與萎縮性胃炎組織相比，有1 288個基因在胃癌組織中高表達(dá)，1 491個基因在胃癌組織中低表達(dá)?；鹕綀D可以更加清晰的顯示差異性基因的表達(dá)情況，綠色表示在萎縮性胃炎組織中低表達(dá)的基因，紅色表示在萎縮性胃炎組織中高表達(dá)的基因，黑色標(biāo)記的基因表示沒有顯著性變化的基因，但是它們的變化倍數(shù)可能很大，或者P值可能極小，見圖1。

圖1 全部檢測基因火山圖差異比較

以變化倍數(shù)(fold change ,FC)的log2為橫軸，以校正后P值的lg值負(fù)數(shù)為縱軸，繪制火山圖，分析全部檢測基因的差異；圖中灰色橫線是校正后P值=0.05的位置，兩條灰色的豎線是FC=2的位置

2.2胃萎縮性炎癥惡變過程中變化最顯著的基因在基因芯片檢測篩選的2 779個差異性表達(dá)的基因中，其中在萎縮性炎惡變過程中變化最為顯著的基因，如上調(diào)的有CXCL1、S100A9、CXCL8、CHI3L1、S100A8、BCL2AL、SAA1、PI3；下調(diào)的有DAZ2、DAZ1、GAST、MSMB、C6orf58、DAZL、KCNE2、GIF、ATP4B、KRT20。具體信息見表1。此外，為了更加直觀的顯示這30個顯著差異表達(dá)的基因在萎縮性胃炎組織及胃癌組織中的表達(dá)水平，使用Cluster 3.0軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果用熱圖展示，見圖2。

圖2 熱圖分析展示

2.3胃萎縮性炎癥惡變過程中差異性表達(dá)基因的GO富集分析為了探索萎縮性胃炎與胃癌組織中差異性基因表達(dá)所代表的生物學(xué)功能，對這些基因進(jìn)行了GO富集分析，GO富集分析是生物信息學(xué)研究中非常重要的工具。共篩選出130個富集的生物過程(校正后的P<0.05)及每個生物過程中所包含的差異性表達(dá)的基因。其中前10個富集的生物學(xué)過程分別是炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞趨化作用、細(xì)胞遷移、血管生成、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞黏附作用、血管內(nèi)皮生長因子的調(diào)節(jié)、趨化因子介導(dǎo)信號通路、脂多糖介導(dǎo)信號通路。圖3直觀地顯示了差異性表達(dá)的基因與富集的生物過程的關(guān)聯(lián)程度。

表1 在胃癌組織中變化最明顯的15個下調(diào)基因和15個上調(diào)基因

2.4胃萎縮性炎癥惡變過程中KEGG信號通路分析為進(jìn)一步研究從胃萎縮性炎惡變至胃癌過程中所涉及的信號通路，對異常表達(dá)的基因進(jìn)行了KEGG信號通路分析。結(jié)果顯示，在KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫中，以P<0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出31條信號通路，其中包括TNF信號通路、NF-kappa B信號通路、化學(xué)致癌作用、趨化因子信號通路、NOD樣受體信號通路等。圖4總結(jié)了前15個差異性最為顯著的信號通路。

2.5差異性表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)分析為了解差異性表達(dá)基因編碼蛋白質(zhì)的功能及蛋白與蛋白之間的功能，將前100名差異性表達(dá)最為顯著的基因輸入STRING 10.0數(shù)據(jù)庫中，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)。研究顯示，在胃萎縮性炎癥惡變至胃癌過程中，差異性表達(dá)基因編碼的蛋白質(zhì)CXCL1、PPBP、CCL20、CXCR2、IL8、STT和SAA1關(guān)聯(lián)程度強(qiáng)； IL6、IL11、MMP3、CSF3和OSM之間也具有明顯的相互作用。

圖3 GO分析顯示差異性表達(dá)的基因富集最顯著的前10個生物過程

圖4 在KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫中差異性表達(dá)的基因富集最明顯的15條信號通路

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

慢性炎癥在腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，研究[4]證明高達(dá)25%的惡性腫瘤繼發(fā)于慢性炎癥，例如胃癌。胃癌在我國仍具有相當(dāng)高的發(fā)病率，發(fā)病機(jī)制不清楚，一般認(rèn)為在萎縮性胃炎基礎(chǔ)上出現(xiàn)腸上皮化生，異型增生，進(jìn)而發(fā)展為胃癌。從萎縮性胃炎惡變至胃癌過程中，分子機(jī)制復(fù)雜多元，其在遺傳和表觀遺傳改變的積累驅(qū)動炎癥細(xì)胞進(jìn)行性轉(zhuǎn)化為惡性衍生物成為研究熱點(diǎn)。此外，胃癌早期診斷對臨床預(yù)后起著很重要的作用，通過對胃癌分子機(jī)制的研究，探討胃癌早期診斷顯得非常重要。

為了更加全面的了解胃癌的發(fā)病機(jī)制，本研究收集了萎縮性胃炎和胃癌組織進(jìn)行基因芯片檢測，共篩選出2 779個差異性表達(dá)的基因，總結(jié)了變化最明顯的15個上調(diào)基因及15個下調(diào)基因。以往的研究已經(jīng)證明了一些基因在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，例如，基因芯片結(jié)果顯示在胃癌組織中高表達(dá)的CXCL8可以增加慢性炎癥惡變至腫瘤的風(fēng)險，并且可以促進(jìn)胃癌的增殖和轉(zhuǎn)移[5]。S100A9和S100A8是一類鈣結(jié)合蛋白，兩者在多種腫瘤中高表達(dá)，可以激活MMP-2的表達(dá)和NF-kappa B 促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的，并且可以作為胃癌臨床診斷標(biāo)志物[6-8]。在胃癌組織中低表達(dá)的KCNE2、SOSTDC1、ATP4A和ATP4B均被報道與胃癌的病理機(jī)制及臨床特征相關(guān)[9-11]。這些基因在胃癌中的表達(dá)情況與我們基因芯片檢測的結(jié)果一致，說明它們在胃萎縮性炎癥惡變過程中發(fā)揮重要作用。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)了一些在胃癌中未見報道的腫瘤相關(guān)基因?；蛐酒Y(jié)果顯示CPA2在胃癌組織中低表達(dá)，最新的研究證明CPA2缺失與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)[12]；HCAR3的高表達(dá)與乳腺癌有關(guān)[13]，本研究顯示其在胃癌發(fā)生過程中上調(diào)。BCL2A1是BCL-2蛋白家族成員，調(diào)控細(xì)胞凋亡，有研究[14]表明它可以作為MYC的靶分子誘導(dǎo)發(fā)生白血病B細(xì)胞白血病。這些腫瘤相關(guān)基因在胃萎縮性炎癥惡變過程中差異性表達(dá)非常顯著，為胃癌發(fā)病分子機(jī)制的研究指出新的方向。

為了探索差異性表達(dá)基因所表示的生理意義，本研究進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。GO分析和KEGG信號通路分析分別展示了在胃萎縮性炎癥惡變過程中富集的生物過程和信號通路。如CXCL1、CXCL8、CCL20、IL11共同參與炎癥反應(yīng)和趨化因子信號通路， BCL2A1 參與NF-kappa B 信號通路，ATP4A和ATP4B共同參與胃酸分泌。ITGAX參與細(xì)胞遷移、黏附和運(yùn)動。腫瘤發(fā)生涉及復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)的改變，本研究使用了PPI網(wǎng)絡(luò)分析胃萎縮性炎惡變過程中基因網(wǎng)絡(luò)的改變，更加清晰地顯示基因編碼蛋白之間的聯(lián)系程度。高表達(dá) IL8、CCL2、TNF-α和OSM的胃癌干細(xì)胞GC-MSCs的培養(yǎng)液可以活化嗜中性粒細(xì)胞，進(jìn)而激活I(lǐng)L6-STAT3信號途徑促進(jìn)胃癌的遷移[15]，此點(diǎn)在PPI基因網(wǎng)絡(luò)圖譜中得到同樣的體現(xiàn)。

本文提供了在胃萎縮性炎癥惡變過程中宏觀基因表達(dá)譜的變化，將為今后的研究提供重要的參考依據(jù)。并且這些差異性表達(dá)的基因可能與胃癌的發(fā)病機(jī)制和臨床特征相關(guān)，但是仍然需要更多的樣本和實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。