瞿子庭，胡永濤，楊孝娟，殷曈昕，朱皓晨，陳思嫻，曹 威，王高遠(yuǎn)，陳曉宇

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以多發(fā)性，對(duì)稱性和增生性滑膜炎為特征的自身免疫病。其病理特征是炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜細(xì)胞增生和血管翳形成[1]。佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠模型是RA藥物治療研究的理想動(dòng)物模型[2]。除侵犯關(guān)節(jié)外，RA患者可發(fā)生脾腫大，脾臟中輔助T細(xì)胞亞群平衡失調(diào)，文獻(xiàn)[3]報(bào)道AA大鼠脾臟存在病理學(xué)損傷。白藜蘆醇(resveratrol,Res)主要存在于葡萄、花生和虎杖中，具有抗炎、抗感染和抗腫瘤的作用[4]。氧化應(yīng)激與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，α-硫辛酸是已被證實(shí)的具有顯著抗氧化應(yīng)激和減輕炎癥作用的藥物[5]。而Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)-核因子NF-E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responsive element,ARE)信號(hào)通路是氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵通路，Nrf2是該通路中的關(guān)鍵蛋白，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，如維持氧化和抗氧化的平衡以及抑制細(xì)胞凋亡等，但Nrf2持續(xù)激活會(huì)使組織受到更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷[6]。該研究旨在探討Res能否通過Keap1-Nrf2/ARE通路調(diào)節(jié)AA大鼠脾臟組織氧化應(yīng)激水平，緩解AA大鼠疾病的發(fā)展進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量(180±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于光照12 h/黑暗12 h，室溫(25±2)℃，通風(fēng)良好并可自由攝食飲水。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 Res、弗氏完全佐劑(FCA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天有限公司；Keap1、Nrf2、錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)等多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；RM2235切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)SHELLAB公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及標(biāo)本收集 隨機(jī)將50只SD大鼠均分為5組：對(duì)照組、模型組、Res低劑量組[5 mg/(kg·d)]、Res高劑量組[100 mg/(kg·d)]和陽(yáng)性藥α-硫辛酸治療組[100 mg/(kg·d)]。喂食1周后，對(duì)照組大鼠皮下注射0.1 ml生理鹽水至左足趾，其余大鼠注射0.1 ml FCA以誘發(fā)炎癥，建立AA大鼠模型。12 d后，對(duì)照組和模型組給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉，Res處理組給予相應(yīng)劑量藥物灌胃；陽(yáng)性藥組給予α-硫辛酸灌胃。每4 d稱重1次并根據(jù)大鼠體重調(diào)整用藥劑量，連續(xù)給予灌藥12 d后處死大鼠，取大鼠脾臟轉(zhuǎn)移至液氮中冷藏備用。另取脾臟固定在4%多聚甲醛中供病理學(xué)檢查。

1.2.2整體模型建立以及關(guān)節(jié)炎指數(shù)和腫脹程度測(cè)定 造模后，每3 d用排水法測(cè)定大鼠左踝關(guān)節(jié)致炎前后容積變化并監(jiān)測(cè)各組大鼠繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)炎指數(shù)，病理評(píng)分分為4個(gè)等級(jí)：0分：正常；1分：踝關(guān)節(jié)紅斑和輕微腫脹；2分：踝關(guān)節(jié)或手掌紅斑，輕微腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)或手掌紅斑及中度腫脹；4分：踝關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹，評(píng)分最高12分。

1.2.3HE染色及病理學(xué)損傷檢測(cè) 取出固定的脾臟組織，脫水，包埋并切片，制備組織厚度為4 μm的切片。取各組切片經(jīng)脫蠟、蘇木精-伊紅(HE)染色、封片處理后，鏡下觀察病理學(xué)損傷。

1.2.4組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè) 從液氮中冷凍的各組脾組織取樣，制成組織勻漿。以14 000 r/min離心15 min并取上清液，根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)MDA含量和SOD活力單位。

1.2.5免疫熒光檢測(cè)大鼠脾臟中Nrf2蛋白的表達(dá) 取出固定的脾臟組織，脫水，包埋并切片，制備組織厚度為4 μm的切片。抗原修復(fù)液修復(fù)，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，封閉液封閉60 min，滴加Nrf2(1 ∶100)多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。第2天，取出復(fù)溫，用PBS沖洗3次，加入熒光二抗，在黑暗條件下孵育30 min，細(xì)胞用DAPI染色5～10 min并在熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá) 取凍存的脾臟組織，提取組織蛋白。根據(jù)BCA試劑盒測(cè)定各組的蛋白質(zhì)含量，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度并加入上樣緩沖液。SDS-PAGE電泳分離90 min；200 mA恒流2 h轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗去封閉液，加入Nrf2、Keap1、MnSOD等一抗(1 ∶300)，4 ℃孵育過夜。用PBST在搖床上洗滌后，將膜放入通用二抗中并在室溫下在搖床上溫育1 h。ECL顯色并使用Image J軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1大鼠AA模型的建立整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相比對(duì)照組，模型組大鼠足趾腫脹程度明顯增加，而Res處理組足趾腫脹程度減輕；關(guān)節(jié)炎評(píng)分結(jié)果顯示：注射FCA 3 d后，大鼠足趾腫脹度即有明顯升高，且隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠繼發(fā)側(cè)足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)均逐漸升高。第12天，模型組大鼠繼發(fā)側(cè)足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.885,P<0.01;t=19.96,P<0.01)。上述結(jié)果表明AA大鼠模型建立成功。Res處理后的大鼠足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低，且隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。見圖1。

圖1 SD大鼠AA關(guān)節(jié)炎模型的建立

圖2 AA大鼠脾臟損傷及氧化應(yīng)激變化

圖3 大鼠脾臟中Nrf2蛋白的表達(dá) 免疫熒光×400

2.2AA大鼠脾臟組織存在損傷與氧化應(yīng)激脾臟HE染色顯示對(duì)照組脾臟組織形態(tài)較為清晰，可見白髓及紅髓區(qū)。相比對(duì)照組，模型組脾組織結(jié)構(gòu)模糊，紅髓髓竇擴(kuò)張，存在淤血，紅髓髓索變窄。相比模型組，Res處理組脾臟形態(tài)結(jié)構(gòu)有明顯改善，紅髓、白髓分界較清晰，紅髓區(qū)可見少量淤血，生發(fā)中心較明顯，細(xì)胞分布均勻。陽(yáng)性藥物治療組效果更好。氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)顯示，相比對(duì)照組，模型組大鼠脾臟勻漿中MDA含量明顯增加(t=6.394,P<0.01)，SOD酶的活力單位明顯降低(t=5.044,P<0.01)；相比模型組，Res和陽(yáng)性藥組大鼠脾臟MDA含量顯著降低 (t=2.218,P<0.05;t=4.513,P<0.01；t=5.333,P<0.01)，SOD酶的活力單位顯著增高(t=26.210,P<0.01；t=3.600,P<0.01；t=3.103,P<0.01)，但藥物處理組間SOD酶的活力單位沒有隨藥物濃度的增加而降低，各組數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.414,P>0.05)。見圖2。

2.3免疫熒光檢測(cè)大鼠脾臟中Nrf2蛋白表達(dá)情況免疫熒光結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠脾臟Nrf2蛋白表達(dá)較少，模型組大鼠脾臟Nrf2 蛋白表達(dá)顯著增加；相比模型組，Res和陽(yáng)性藥組Nrf2蛋白表達(dá)減少。在Res和陽(yáng)性藥組，相比于周圍紅髓，脾組織的淋巴小結(jié)Nrf2蛋白表達(dá)較弱，而紅髓處免疫熒光明顯增強(qiáng)，見圖3。

2.4Westernblot測(cè)定大鼠脾臟中氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Western blot結(jié)果顯示，模型組脾臟相比對(duì)照組，其蛋白Nrf2(t=7.159,P<0.01)和MnSOD(t=6.850,P<0.01)的表達(dá)增加，Keap1(t=16.670,P<0.01)表達(dá)降低?；叶缺戎蛋攵糠治霰砻?，相比模型組大鼠，Res高劑量組脾臟組織中Keap1(t=10.240,P<0.01)、MnSOD(t=6.217,P<0.01)、Nrf2(t=12.660,P<0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各濃度Res處理組間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相比模型組，陽(yáng)性藥組Nrf2表達(dá)降低，也呈下降趨勢(shì)，Keap1、MnSOD表達(dá)增加。見圖4。

圖4 Western blot測(cè)定大鼠脾臟組織勻漿

3 討論

本研究采用FCA制備AA模型，F(xiàn)CA誘導(dǎo)炎癥后的病理變化與RA較為相近[7]。研究[8]表明，AA大鼠滑膜呈現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)部位表現(xiàn)為關(guān)節(jié)囊腫脹或粘連，病理學(xué)表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞異常增生，血管翳形成及軟骨和骨破壞。本研究AA大鼠在致炎后的7～12 d出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹程度升高，炎癥進(jìn)一步發(fā)展，踝關(guān)節(jié)腫脹程度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)證明AA模型建立成功，HE染色結(jié)果表明Res能夠減輕脾臟的病理?yè)p傷。此外，RA可逐漸累及其他組織臟器，如心、肝、脾等，表現(xiàn)為多系統(tǒng)、多臟器受損。

Res是虎杖的一種提取物，具有抗炎和抗脂質(zhì)過氧化等生物學(xué)作用[9]。本研究在AA大鼠基礎(chǔ)上觀察脾臟的病變特點(diǎn)。脾臟損傷主要表現(xiàn)為脾組織結(jié)構(gòu)模糊、紅髓髓竇擴(kuò)張淤血等。相比模型組，Res和陽(yáng)性藥組脾組織的病理學(xué)變化減輕，大鼠脾臟組織勻漿檢測(cè)中，MDA含量的降低和SOD活力單位的升高表明大鼠脾臟的抗氧化應(yīng)激增強(qiáng)，證實(shí)了Res的調(diào)節(jié)作用。

Keap1-Nrf2/ARE通路是氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵通路，其中Nrf2為機(jī)體降低活性氧、減輕氧化應(yīng)激重要轉(zhuǎn)錄因子，Keap1是調(diào)節(jié)Nrf2活性的細(xì)胞抗氧化途徑的調(diào)節(jié)蛋白。正常情況下Nrf2在胞質(zhì)中與抑制因子Keap1結(jié)合，處于失活狀態(tài)，無法進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，當(dāng)受到ROS刺激時(shí)，Keap1構(gòu)象改變后與Nrf2 解離[10]。激活的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核并與小Maf蛋白形成異源二聚體，其與ARE結(jié)合并促進(jìn)下游靶基因的表達(dá)，介導(dǎo)一系列抗氧化應(yīng)激酶的產(chǎn)生，如MnSOD、血紅素氧合酶1(HO-1)等，提高機(jī)體抗氧化能力[11]。在氧化還原平衡恢復(fù)后Nrf2返回胞質(zhì)中，經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解或通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)使其消耗后維持正常水平[12]。已有研究[8]表明RA患者體內(nèi)存在氧化應(yīng)激，但關(guān)于Keap1-Nrf2/ARE通路在RA發(fā)生發(fā)展中影響的研究尚少。

Western blot結(jié)果顯示，AA大鼠脾臟組織中Nrf2和MnSOD的表達(dá)顯著增加，處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)，Keap1-Nrf2/ARE通路異常激活。相比對(duì)照組，模型組脾臟組織Keap1蛋白表達(dá)明顯減少，對(duì)Nrf2的抑制能力減弱。Nrf2和MnSOD表達(dá)增加，表明脾臟處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，過度激活 Keap1- Nrf2/ARE通路會(huì)加重脾臟中的氧化應(yīng)激。給予Res處理后，Nrf2蛋白表達(dá)減少，呈下降趨勢(shì)，Keap1和MnSOD表達(dá)增加，Keap1大量表達(dá)導(dǎo)致從Keap1解離的Nrf2減少,進(jìn)而抑制Keap1-Nrf2/ARE通路過度激活,起到對(duì)脾臟組織的保護(hù)作用[13]。而有研究[14]則表明，Res可上調(diào)Nrf2的表達(dá)。本研究免疫熒光結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，模型組大鼠脾臟中Nrf2蛋白表達(dá)明顯增加，表明模型組脾臟組織存在Nrf2過度激活。相比模型組，Res和陽(yáng)性藥組Nrf2蛋白表達(dá)減弱，氧化應(yīng)激程度減輕。值得關(guān)注的是，在Res和陽(yáng)性藥組中，相比于周圍紅髓，白髓淋巴小結(jié)Nrf2蛋白表達(dá)明顯較弱，提示和紅髓相比，白髓氧化應(yīng)激程度較輕。白髓主要由B淋巴細(xì)胞組成，而紅髓主要含有大量T淋巴細(xì)胞，Th細(xì)胞的免疫功能障礙在RA發(fā)病機(jī)制中起重要作用，B淋巴細(xì)胞通過遞呈抗原、產(chǎn)生自身抗體和分泌細(xì)胞因子等與RA發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。免疫熒光結(jié)果提示Res可能通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞及相關(guān)因子的表達(dá)來減輕AA大鼠脾臟損傷。

綜上所述，AA大鼠存在脾臟功能的受損，Res可減輕AA大鼠病理?yè)p傷，同時(shí)改善其脾臟功能，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路異常激活，下調(diào)MDA水平，上調(diào)抗氧化蛋白MnSOD表達(dá)有關(guān)。此外，Res通過何種方式來降低Nrf2的表達(dá)，此方式通過影響哪些物質(zhì)降低Nrf2的表達(dá)，Res對(duì)RA的調(diào)節(jié)與淋巴細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子存在何種關(guān)系，這些問題都有待進(jìn)一步研究。