張傳海，張鶴松，桂 陽，郭鳳林，馬金良，余繼海

肝癌以發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、病死率高成為嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病，2012年的調(diào)查顯示每年全世界約有76萬人死于肝癌，占癌癥總死亡人數(shù)的9.1%，在惡性腫瘤中居于第二位，而我國肝癌的發(fā)病率和死亡率居于第四位。肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝癌最常見的臨床類型，約占肝癌的80%[1-3]。課題組前期的體外實(shí)驗(yàn)[4]證實(shí)miR-7可通過結(jié)合表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)3′-UTR非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)，抑制EGFR信號通路活性，進(jìn)而抑制人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株(highly invasive human hepatocellular carcinoma cell，MHCC-97H上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變(epithelial mesenchymal transition，EMT)，降低MHCC-97H的侵襲、遷移能力[4]。該研究擬通過比較分析microRNA(miR)-7在肝癌組織中的表達(dá)及其與HCC病理學(xué)特性、EMT之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討其在HCC中的重要作用，為深入探討HCC特異性、敏感性早期診斷指標(biāo)及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制、臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料30組HCC組織標(biāo)本取自2016年1月～2017年6月安徽省立醫(yī)院肝膽外科手術(shù)切除的HCC組織及癌旁組織(距離癌組織5 cm以上)。所有組織標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理檢測證實(shí)為HCC，術(shù)前均未接受抗腫瘤治療，并且與患者或家屬進(jìn)行了充分溝通并簽署了實(shí)驗(yàn)知情同意書。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；Real-time PCR試劑購自日本TaKaRa公司；Real-time PCR引物購自美國Invitrogen公司；GAPDH、E-cadherin、N-cadherin抗體購自美國Santa Cruz公司；ABI 7500 Real-time PCR儀購自美國ABI公司。

1.2方法

1.2.1Real-time PCR 參照RNA提取試劑盒說明書提取組織總RNA。以總RNA為模板，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，使用ABI 7500 Real-time PCR儀檢測U6、GAPDH、miR-7、E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)。其中，miR-7和U6的上游引物序列分別為：5′-TGGAAGACTAGTGATT-3′和5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下游引物為通用引物；E-cadherin上游引物：5′-TCGCTTACACCATCCTCAGC-3′，下游引物：5′-GGAAACTCTCTCGGTCCAGC-3′；N-cadherin上游引物：5′-AACAGCAACGACGGGTTAGT-3′，下游引物：5′-CAGACACGGTTGCAGTTGAC-3′；GAPDH上游引物：5′- GCCGCATCTTCTTTTGCGTC -3′，下游引物：5′- TACGACCAAATCCGTTGACTCC -3′。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。分析miR-7以U6為內(nèi)參，分析E-cadherin和N-cadherin則以GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.2Western blot 應(yīng)用RIPA(強(qiáng))細(xì)胞裂解液進(jìn)行冰上勻漿操作，提取組織總蛋白，BCA法定量后，按50 μg/孔的量加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜。各蛋白的轉(zhuǎn)膜條件分別為GADPH：120 mA，2 h；E-cadherin：150 mA，3 h；N-cadherin：150 mA，3 h；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，應(yīng)用濃度為5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，TBST洗膜 3 min。分別參考抗體說明書進(jìn)行抗體稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。相應(yīng)二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL發(fā)光、顯影，以GAPDH為內(nèi)參，分析各指標(biāo)的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1miR-7的表達(dá)情況與癌旁組織比較，癌組織中miR-7的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.753，P=0.000)。與非轉(zhuǎn)移性癌組織比較，轉(zhuǎn)移性癌組織中miR-7的表達(dá)亦明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.600，P=0.047)，見圖1。

2.2E-cadherin、N-cadherin的表達(dá)情況Real-time PCR和Western blot檢測結(jié)果均表明，與癌旁組織比較，癌組織中E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.085，P=0.000；F=4.072，P=0.000)，而N-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=122.6，P=0.000；F=5.751，P=0.000)。見圖2、3。

2.3miR-7的表達(dá)與E-cadherin、N-cadherin之間的關(guān)系相關(guān)性分析表明，miR-7在HCC組織中的表達(dá)與E-cadherin呈正相關(guān)性(r=0.426)，與N-cadherin呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.182)。見圖4。

2.4miR-7與HCC臨床病理特征之間的相關(guān)性臨床病理資料分析結(jié)果表明，miR-7在HCC中的表達(dá)與患者年齡、性別、HBV感染均無相關(guān)性(P>0.05)，與TNM分期、分化程度、血管浸潤密切相關(guān)(P<0.05)。見表1。

3 討論

miRs是一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA，可靶向作用mRNA而參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，是近年來研究腫瘤發(fā)病分子機(jī)制的熱點(diǎn)。其中，miR-1、miR-25、miR-206、miR-375等具有腫瘤特異性，有可能成為檢測腫瘤的血清生物學(xué)的標(biāo)志物[5-7]。研究[8-9]表明，miR-7具有抑癌基因特性，可抑制肺癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等多種腫瘤的侵襲、遷移。Webster et al[10]研究證明，miR-7可通過調(diào)節(jié)EGFR信號途徑而抑制肺癌、乳腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等的發(fā)生發(fā)展。Wang et al[11]研究表明，miR-7可通過抑制癌基因電壓依賴性陰離子通道1的表達(dá)而降低HCC的增殖及轉(zhuǎn)移。同樣，課題組前期實(shí)驗(yàn)研究[4]表明，miR-7可通過結(jié)合EGFR 3′-UTR，抑制EGFR信號通路活性，進(jìn)而抑制MHCC-97H細(xì)胞EMT，降低MHCC-97H細(xì)胞侵襲、遷移能力。

圖1 miR-7在不同組織中的差異性表達(dá)

表1 miR-7與HCC臨床病理特征之間的相關(guān)性分析

圖2 E-cadherin、N-cadherin mRNA在不同組織中的差異性表達(dá)分析與癌旁組織比較：**P<0.01

圖3 E-cadherin、N-cadherin蛋白在不同組織中的差異性表達(dá)分析

圖4 miR-7的表達(dá)與E-cadherin、N-cadherin分析

EMT是反映細(xì)胞侵襲、遷移能力的重要指標(biāo)，抑制EMT可減弱肝癌的轉(zhuǎn)移，從而提高肝癌的臨床治療效果，降低肝癌復(fù)發(fā)率。因此，本研究以miR-7與HCC EMT之間的關(guān)系為切入點(diǎn)，研究表明miR-7在HCC癌組織的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.01)，并且miR-7在轉(zhuǎn)移性HCC癌組織的表達(dá)水平顯著低于非轉(zhuǎn)移性HCC癌組織(P<0.01)，再次證實(shí)miR-7的異常表達(dá)與HCC的發(fā)生發(fā)展具有密切相關(guān)性，其具有作為診斷HCC潛在指標(biāo)的可能性，檢測miR-7的表達(dá)情況對HCC的臨床診斷、治療及預(yù)后判斷有潛在的重要意義。

然而，由于miR-7作用途徑的多樣性、作用機(jī)制的復(fù)雜性，后期將通過進(jìn)行更加深入廣泛的研究，進(jìn)一步闡述其在HCC中的生物學(xué)功能，以期為HCC的發(fā)病機(jī)制研究提供新思路。