劉健 萬磊 孫玥 章平衡 忻凌 姜輝 方妍妍 董文哲 文建庭

【摘 要】目的：觀察類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細(xì)胞lncRNA差異表達(dá)。方法：選取安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者（類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組）及健康體檢者（正常對照組），每組3例。抽取2組研究對象的外周血，利用高通量基因測序技術(shù)檢測外周血單個核細(xì)胞lncRNA和mRNA表達(dá)，GO分析及KEGG信號通路分析差異表達(dá)的lncRNA功能分布，構(gòu)建lncRNA-mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并在此基礎(chǔ)上通過Cis和Trans預(yù)測可能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎凋亡、氧化應(yīng)激、信號通路相關(guān)lncRNA。利用RT-PCR方法驗證lncRNA。結(jié)果：通過lncRNA測序分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組與正常對照組存在明顯差異表達(dá)。共有9158條差異表達(dá)的lncRNA（差異倍數(shù)≥2，且P≤0.05），表達(dá)上調(diào)的有5682條，下調(diào)的有3476條;差異表達(dá)的mRNA共有7895條。GO分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的mRNA主要參與免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞代謝、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、骨髓白細(xì)胞活化、血小板細(xì)胞活化等。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的mRNA主要參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、細(xì)胞衰老、信號通路等方面。通過RT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)，與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的細(xì)胞凋亡lncRNA為ENST00000619282、ENST00000637683、ENST00000511703，氧化應(yīng)激為HOTAIRM1、DANCR，Notch通路為MALAT1、CARMN、LINC-PINT。結(jié)論：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血淋巴細(xì)胞中差異表達(dá)的lncRNA異常表達(dá)，可能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及信號通路失衡有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕;長鏈非編碼RNA;細(xì)胞凋亡;氧化應(yīng)激;Notch信號通路;高通量基因測序

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種累及周圍關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)性、炎癥性的自身免疫性疾病[1-2]。RA疾病發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著機(jī)體免疫細(xì)胞增殖和凋亡動態(tài)的失衡，氧化應(yīng)激激活及包括Notch通路在內(nèi)的多種信號傳導(dǎo)通路失衡，導(dǎo)致免疫炎癥的發(fā)生，最終促進(jìn)RA疾病的發(fā)生發(fā)展[3-4]。RA發(fā)病機(jī)制目前仍不明確。隨著近年來高通量基因測序技術(shù)的發(fā)展，對于RA基因表達(dá)譜的研究越來越受到學(xué)者關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA（long-chain non-coding RNA，lncRNA）可能在RA的發(fā)病過程中起到相當(dāng)重要的作用。lncRNA可能在RA機(jī)體的滑膜細(xì)胞凋亡、免疫炎癥、氧化應(yīng)激及信號通路傳導(dǎo)失衡過程中起到重要作用。lncRNA是由非編碼序列轉(zhuǎn)錄生成的長度 > 200 nt的RNA，目前尚未發(fā)現(xiàn)它翻譯成蛋白質(zhì)的功能。但是它可以通過與其他基因特異性結(jié)合，或與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，從而發(fā)揮多種生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者中差異表達(dá)的lncRNA共有1615條[5]，RA患者外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）中呈異常表達(dá)的lncRNA有242個[6]。因此，通過觀察lncRNA在RA中表達(dá)差異的變化，從而可以把lncRNA作為靶向治療靶點(diǎn)以達(dá)到緩解甚至治愈RA的目的。本研究采用高通量基因測序技術(shù)篩選正常人和RA患者外周血淋巴細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜，分析lncRNA差異表達(dá)情況，并探討RA與lncRNA的關(guān)系，為RA尋找新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 資 料

1.1 臨床資料 選取2018年9月至2018年11月在安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的住院RA患者（RA組）3例，年齡40～55歲;均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）2010年RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選同期3例健康體檢者為正常對照組（NC組），年齡35～55歲。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及患者及健康對照人群的知情同意（倫理號2018AH-19）。

1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清（四季青）;人淋巴細(xì)胞分離液（南京三生生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)）;RNA提取試劑（Thermo Fisher Scientific公司）;RT-qPCR試劑盒（上海近岸科技有限公司）;引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，測序、圖像采集、數(shù)據(jù)分析由雨希生物科技（上海）有限公司完成。

2 方 法

2.1 細(xì)胞收集 采集RA組和NC組外周靜脈血10 mL，離心。利用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行分選，血細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)及淋巴細(xì)胞的純度檢測。下層血細(xì)胞用淋巴細(xì)胞分離液梯度離心，分離獲得PBMCs用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細(xì)胞，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 測序類型的選擇 采用測序平臺的雙端151 bp測序模式對樣本進(jìn)行去核糖體rRNA的RNA測序，利用軟件對測序數(shù)據(jù)從3'端動態(tài)去除接頭序列片段和低質(zhì)量片段，利用軟件對預(yù)處理數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制分析以及統(tǒng)計Q20、Q30的堿基比例。然后去除第1端序列前5 bp，采用軟件將預(yù)處理數(shù)據(jù)依次比對于rRNA序列數(shù)據(jù)庫?？赏瑫r對lncRNA和mRNA進(jìn)行檢測，并挖掘出兩者的關(guān)聯(lián)。

2.3 總RNA提取 分別提取RA組和NC組淋巴細(xì)胞中的總RNA后，純化總RNA。瓊脂糖凝膠電泳，對總RNA進(jìn)行定量和質(zhì)量分析。

2.4 lncRNA表達(dá)譜分析 對3例RA患者和3例健康體檢者進(jìn)行高通量基因測序分析。lncRNA表達(dá)譜分析由雨希生物科技（上海）有限公司完成。針對mRNA和lncRNA轉(zhuǎn)錄本，根據(jù)樣本的實驗設(shè)計，利用軟件對不同樣本組之間篩選差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。靶基因轉(zhuǎn)錄本（GO）分析描述差異表達(dá)的mRNAs功能屬性。京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路分析差異表達(dá)mRNAs生物學(xué)途徑。順勢（Cis）、反式（Trans）靶標(biāo)預(yù)測可能與RA 發(fā)生相關(guān)的lncRNA。

2.5 RT-PCR驗證 以3例RA患者和3例健康體檢者為研究對象，在篩選出來的差異表達(dá)lncRNA中，挑選差異倍數(shù)較大的lncRNA，以內(nèi)參（β-actin）作為參照，采用熒光染料摻入相對定量法進(jìn)行RT-qPCR驗證。引物序列見表1。按照RNA提取說明提取RA組和NC組RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA及PCR擴(kuò)增，最后計算2-△△CT。

3 結(jié) 果

3.1 總RNA樣本質(zhì)量分析 通過采用illuminaNovaseq6000測序儀檢測，對每個RNA樣本的堿基位置、長度等分析，均達(dá)到質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)，能夠滿足實驗需要。

3.2 差異表達(dá)的lncRNA和mRNA 通過lncRNA測序分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA在RA組與NC組存在明顯差異表達(dá)。共有9158條差異表達(dá)的lncRNA（差異倍數(shù)≥2，且P≤0.05），表達(dá)上調(diào)的有5682條，下調(diào)的有3476條;差異表達(dá)的mRNA共有7895條。

分別對其中表達(dá)上調(diào)、下調(diào)倍數(shù)最明顯的20條lncRNA和mRNAs進(jìn)行聚類分析圖顯示，可直觀地看到2組lncRNAs與mRNAs的表達(dá)差異，同組樣本聚在一起，說明樣本間基因表達(dá)趨勢一致。紅色到綠色，顏色越深代表差異越明顯。

3.3 生物信息學(xué)分析 GO分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的mRNA主要參與免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞代謝、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、骨髓白細(xì)胞活化、血小板細(xì)胞活化等功能。KEGG信號通路分析顯示，差異表達(dá)的mRNA主要參與RA、細(xì)胞衰老、信號通路等方面功能的基因有顯著變化。并在此基礎(chǔ)上經(jīng)Cis、Trans預(yù)測，RA細(xì)胞凋亡方面，與B細(xì)胞淋巴瘤（BCL）2L14、BCL2L13、核轉(zhuǎn)錄因子-κB1（NF-κB1）、信號通路（Notch通路）密切相關(guān)的mRNA為白細(xì)胞介素（IL）-15、IL-6、人白細(xì)胞抗原DRB5（HLA-DRB5）等。因此與之相關(guān)的lncRNA細(xì)胞凋亡為ENST00000619282、ENST00000637683和ENST00000511703;氧化應(yīng)激為HOTAIRM1、DANCR;Notch通路為MALAT1、CARMN、LINC-PINT。

3.4 qRT-PCR對lncRNA驗證

3.4.1 細(xì)胞凋亡相關(guān) lncRNA驗證 選取與RA關(guān)系密切卻差異表達(dá)較為顯著的lncRNA（主要包括ENST00000619282、ENST00000637683和ENST00000511703）進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證，結(jié)果顯示，與高通量測序檢測結(jié)果一致，ENST00000619282、ENST00000637683表達(dá)上調(diào)，ENST00000511703下調(diào)。

3.4.2 氧化應(yīng)激相關(guān)lncRNA驗證 選取與RA氧化應(yīng)激方面關(guān)系最為密切且表達(dá)差異較為顯著的lncRNA HOTAIRM1、DANCR進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證。結(jié)果顯示與基因測序結(jié)果一致。

3.4.3 Notch通路相關(guān)lncRNA驗證 選取差異表達(dá)較多的MALAT1、CARMN、LINC-PINT對測序結(jié)果進(jìn)行實時熒光定量PCR驗證。3條lncRNA在驗證時發(fā)現(xiàn)，CARMN、LINC-PINT在RA組與NC組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），MALAT1組間比較顯示，RA組MALAT1較NC組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。lncRNA MALAT1得到了較好的驗證。

4 討 論

RA病因病機(jī)尚不明確，其高致殘率引起了社會的廣泛關(guān)注。大部分RA患者在確診時全身多個關(guān)節(jié)己經(jīng)出現(xiàn)破壞，失去了最佳治療時期。因此，RA早期診斷顯得尤為必要。

研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在腫瘤[7]、心腦血管[8]、自身免疫[9]等多種疾病中發(fā)揮著重要作用。目前研究認(rèn)為，RA發(fā)病與機(jī)體的各種免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞、巨噬細(xì)胞水平失衡有關(guān)。免疫細(xì)胞活化過程與lncRNA水平密切相關(guān)，lncRNA能夠調(diào)控免疫細(xì)胞的分化、分泌、凋亡、增殖等多種生物功能[10-12]。

lncRNA在RA病理生理過程中發(fā)揮的作用越來越大。RA患者是否存在差異表達(dá)的lncRNA？本研究發(fā)現(xiàn)，RA組與NC組共有9158條差異表達(dá)的lncRNA，上調(diào)的有5682條，下調(diào)的有3476條，差異表達(dá)的mRNA共有7895條，說明RA體內(nèi)存在差異表達(dá)的lncRNA。進(jìn)一步通過差異表達(dá)高倍lncRNAs與mRNAs的分析發(fā)現(xiàn)，mRNA主要與免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝、骨髓白細(xì)胞活化、血小板細(xì)胞活化等功能有關(guān)。KEGG信號通路分析顯示，差異表達(dá)的mRNA主要參與RA、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、Notch信號通路等方面。

lncRNA在RA免疫炎癥、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和信號通路傳導(dǎo)失衡等過程起到重要作用。RA中過表達(dá)的lncRNA HOTAIR能夠抑制miR-138引起細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)lncRNA HOTAIR能夠明顯抑制NF-κB信號通路的活化，導(dǎo)致IL-1β和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）下調(diào)，從而抑制免疫炎癥反應(yīng)[14]。研究證明，RA疾病的發(fā)展與CD4+T細(xì)胞的凋亡異常有關(guān)[15-16]。RA外周血中Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3、BCL2-Associated X的蛋白質(zhì)（Bax）mRNA相對表達(dá)降低，Bcl-2升高[17]。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血CD4+T細(xì)胞凋亡缺陷相關(guān)Bcl-2 mRNA與RA疾病密切相關(guān)[17-18]，本研究通過高通量基因技術(shù)篩選RA患者外周血淋巴細(xì)胞中異常表達(dá)的lncRNAs，找出3個表達(dá)差異比較顯著的lncRNA與RA外周血淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，lncRNA ENST00000619282、ENST00000637683和ENST00000511703可能參與了RA細(xì)胞凋亡的過程，并通過驗證結(jié)果與高通量基因測序結(jié)果一致。因此，lncRNA可能競爭性結(jié)合某些凋亡因子，調(diào)控細(xì)胞凋亡水平，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞凋亡逃逸，導(dǎo)致RA免疫炎癥反應(yīng)。RA氧化應(yīng)激中過氧化導(dǎo)致一系列炎性細(xì)胞因子浸潤、蛋白酶分泌增加、產(chǎn)生大量氧化產(chǎn)物[19]。而RA患者線粒體膜因氧化應(yīng)激去極化的過程，有利于線粒體的內(nèi)容物大量進(jìn)入胞質(zhì)，參與自身抗體的產(chǎn)生，成為炎癥反應(yīng)中的重要環(huán)節(jié)[20]。lncRNA在氧化應(yīng)激中發(fā)揮著重要作用，參與廣泛細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)，lncRNA與細(xì)胞衰老、氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生和維持有關(guān)。lncRNA?HOTAIR能夠調(diào)節(jié)NF-κB信號通路，影響RA氧化應(yīng)激和免疫炎癥反應(yīng)[21]。本研究觀察與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的lncRNA HOTAIRM1、DANCR在RA患者單核細(xì)胞表達(dá)顯著增高，可能參與了RA的發(fā)生，并通過QRT-PCR方法進(jìn)行驗證，結(jié)果與基因測序結(jié)果一致。Notch信號通路在RA發(fā)病中起重要作用，其過激活可導(dǎo)致RA滑膜炎癥反應(yīng)加重。本研究結(jié)果顯示，lncRNA MALAT1參與RA發(fā)病過程，與PAN等[22]研究結(jié)果相似。lncRNA MALAT1可通過調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)影響Notch通路，lnc-MALAT1募集pre-miR-155剪接因子至細(xì)胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，調(diào)控靶基因表達(dá)[23]，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖、分化功能減弱。進(jìn)一步激活Notch通路，從而導(dǎo)致RA滑膜炎癥及骨質(zhì)破壞。

綜上所述，本研究通過高通量基因測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了RA外周血淋巴細(xì)胞中存在差異表達(dá)的lncRNAs，但其中大部分lncRNA的生物功能尚不可知。今后筆者將繼續(xù)深入研究RA凋亡、氧化應(yīng)激、Notch信號通路相關(guān)lncRNA，并發(fā)掘與lncRNA相關(guān)的miRNA，研究兩者之間的關(guān)系，以期為RA疾病的有效治療提供新的依據(jù)和靶點(diǎn)。

5 參考文獻(xiàn)

[1] ZHANG TP，ZHANG Q，WU J，et al.The expression levels of long noncoding RNAs lnc0640 and lnc5150 and its gene single-nucleotide polymorphisms in rheumatoid arthritis patients[J].J Cell Biochem，2018，119（12）：10095-10106.

[2] ZHAO D，JIANG Z，WANG Z，et al.Retinoid interferon-induced mortality19（GRIM9）inhibits proliferation and invasion in rheumatoid arthitis fibroblast-like synoviocytes[J].Biomed Pharmacother，2018（98）：719-725.

[3] WAN L，LIU J.Changes of CD4+CD25+ Regulatory T Cells，F(xiàn)oxP3 in Adjuvant Arthritis Rats with Damage of Pulmonary Function and Effects of Tripterygium Glycosides Tablet[J].Int J Rheumatol，2012（318）：348450.

[4] 曾小峰，朱松林，譚愛春，等.我國類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病負(fù)擔(dān)和生存質(zhì)量研究的系統(tǒng)評價[J].中國循證醫(yī)學(xué)雜志，2013，13（3）：300-307.

[5] 夏燕，馮佳，陳安平，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎外周血lncRNA差異表達(dá)研究[J].中國免疫學(xué)雜志，2016，32（1）：9-12.

[6] 袁敏，徐黎明，鄭娟，等.lncRNA在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞中的異常表達(dá)[J].山東醫(yī)藥，2018，58（10）：63-65.

[7] ZHAO Y，LIU Y，LIN L，et al.The lncRNA MACC1-AS1 promotes gastric cancer cell metabolic plasticity via AMPK/Lin28 mediated mRNA stability of MACC1[J].Mol Cancer，2018，17（1）：69.

[8] LIANG H，PAN Z，ZHAO X，et al.LncRNA PFL contributes to cardiac fibrosis by acting as a competing endogenous RNA of let-7d[J].Theranostics，2018，8（4）：1180-1194.

[9] HUANG W，THOMAS B，F(xiàn)LYNN RA，et al.Retraction Note：DDX5 and its associated lncRNA Rmrp modulate TH17 cell effector functions[J].Nature，2018，562（7725）：150.

[10] 李有強(qiáng)，張云燕，陳茶，等.3-O-C12-HSL阻礙Mo-DCs成熟過程中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的變化[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2018，43（1）：117-121.

[11] 崔桂榮，李焱，賈振薇，等.LncRNA AK093987在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者中的表達(dá)及其臨床意義[J].腫瘤學(xué)雜志，2018，24（4）：360-364.

[12] 鄧楨，姚芳苡，葉建青，等.長鏈非編碼RNA在脂多糖誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的表達(dá)變化[J].中華危重病急救醫(yī)學(xué)，2017，29（4）：306-310.

[13] YANG KY，CHEN DL.Shikonin Inhibits Inflammatory Response in Rheumatoid Arthritis Synovial Fibroblasts via lncRNA-NR024118[J].Evid Based Complement Alternat Med，2015，2015：631737.

[14] ZHANG HJ，WEI QF，WANG SJ，et al.LncRNA HOTAIR alleviates rheumatoid arthritis by targeting miR-138 and inactivating NF-κB pathway[J].Int Immunopharmacol，2017（50）：283-290.

[15] LI N，MA T，HAN J，et al.Increased apoptosis induction in CD4+ CD25+ Foxp3+ T cells contributes to enhanced disease activity in patients with rheumatoid arthritis through IL-10 regulation[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014，18（1）：78-85.

[16] TOUBI E，KESSEL A，MAHMUDOV Z，et al.Increased Spontaneous Apoptosis of CD4+CD25+ T Cells in Patients with Active Rheumatoid Arthritis Is Reduced by Infliximab[J].Ann N Y Acad Sci，2010，1051（1）：506-514.

[17] 曹永賀，劉健.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者細(xì)胞凋亡與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，36（1）：35-39.

[18] 劉健，章平衡，黃旦，等.lncRNA在風(fēng)濕病中的研究進(jìn)展[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2018，7（12）：58-63.

[19] KUNDU S，GHOSH P，DATTA S，et al.Oxidative stress as a potential biomarker for determining disease activity in patients with rheumatoid arthritis[J].Free Radic Res，2012，46（12）：1482-1489.

[20] STAVROPOULOS-KALINOGLOU A，DELI C，KITAS GD，et al.Muscle wasting in rheumatoid arthritis：The role of oxidative stress[J].World J Rheumatol，2014，4（3）：44-53.

[21] ZHANG HJ，WEI QF，WANG SJ，et al.LncRNA HOTAIR alleviates rheumatoid arthritis by targeting miR-138 and inactivating NF-κB pathway[J].Int Immunopharmacol，2017（50）：283-290.

[22] PAN F，ZHU L，LV H，et al.Quercetin promotes the apoptosis of fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis by upregulating lncRNA MALAT1[J].Int J Mol Med，2016，38（5）：1507-1514.

[23] WU J，ZHANG H，ZHENG Y，et al.The Long Noncoding RNA MALAT1 Induces Tolerogenic Dendritic Cells and Regulatory T Cells via miR155/Dendritic Cell-Specific Intercellular Adhesion Molecule-3 Grabbing Nonintegrin/IL10 Axis[J].Front Immunol，2018，13（9）：1847.

收稿日期：2018-12-15;修回日期：2018-12-31