程曉平 鄭文偉 倪國新

【摘 要】目的：利用生物信息學(xué)對骨關(guān)節(jié)炎與正常關(guān)節(jié)滑膜間差異基因進(jìn)行分析，探索骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制。方法：從GEO數(shù)據(jù)庫下載關(guān)節(jié)滑膜基因芯片數(shù)據(jù)庫，利用GEO2R篩選出差異基因，DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫對差異基因進(jìn)行功能GO分析及KEGG信號通路分析，String-db數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI），并采用Cytoscape 3.6.1軟件獲取關(guān)鍵靶基因。結(jié)果：GEO2R共篩選出差異基因490個，包含上調(diào)基因61個，下調(diào)基因429個，其主要涉及細(xì)胞分化、細(xì)胞生長、骨骼肌器官發(fā)育、cAMP反應(yīng)等生理過程，且主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)受體互作、近端腎小管重吸收碳酸氫鹽、胃酸分泌、催產(chǎn)素、環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶G、脂肪細(xì)胞因子信號通路中。從PPI網(wǎng)絡(luò)中共獲取13個關(guān)鍵靶基因，包含F(xiàn)OS、SMARCA4、SOCS3、LEP、FBXO32、MYOD1、TRIM63、SMARCA2、CALB1、MAPK12、ADIPOQ、TTN、EGR1。結(jié)論：利用生物信息學(xué)從不同角度揭示骨關(guān)節(jié)炎與正常關(guān)節(jié)滑膜間差異基因潛在特征，為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供新的思路。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎;滑膜;差異基因;生物信息學(xué)

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見于中老年人的慢性、退行性關(guān)節(jié)疾病，目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]。以往對OA的研究主要以軟骨細(xì)胞、關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨為主，但隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)中的滑膜在OA的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要調(diào)節(jié)作用[2]。OA患者常常伴隨著滑膜炎，而滑膜炎反過來又會進(jìn)一步引起關(guān)節(jié)軟骨破壞，加重OA病情[3]。因此，本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫獲取OA患者和正常人滑膜基因芯片數(shù)據(jù)，并對其進(jìn)行處理分析，旨在從中尋找出滑膜調(diào)控OA的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為OA的治療提供新的思路。

1 資料和方法

1.1 資料來源 輸入網(wǎng)址（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/），從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE82107關(guān)節(jié)滑膜基因表達(dá)數(shù)據(jù)。所采用的平臺為[HG-U133-Plus-2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，共有7例正常人和10例OA患者。

1.2 數(shù)據(jù)分析軟件及數(shù)據(jù)庫 GEO2R（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）、DAVID6.7（https：//david.ncifcrf.gov/）、String-db（https：//string-db.org/）在線分析數(shù)據(jù)庫，Cytoscape 3.6.1分析軟件。

1.3 差異基因獲取 將7例正常人作為對照組，10例OA患者作為模型組，利用GEO2R的R語言程序?qū)?組滑膜樣本的相關(guān)基因進(jìn)行分析。并以P < 0.05且差異倍數(shù)|logFC|≥2作為差異基因的篩選條件。

1.4 差異基因分析 采用DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫對所獲得的差異基因進(jìn)行功能GO分析及KEGG信號通路分析。采用String-db數(shù)據(jù)庫對差異基因編碼蛋白之間的相互作用（PPI）進(jìn)行分析。采用Cytoscape 3.6.1軟件獲取PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的關(guān)鍵靶基因。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因 以P < 0.05且差異倍數(shù)|logFC|≥2為篩選條件，從2組滑膜樣本中共篩選出差異基因490個，其中含上調(diào)基因61個，下調(diào)基因429個（表1僅列出前10名上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因）。同時把上調(diào)和下調(diào)差異基因的前30名做熱圖。

2.2 差異基因功能GO分析 將490個差異基因?qū)隓AVID 6.7數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，這些基因共涉及58種生物學(xué)過程，其中FDR < 0.01的生物過程有30種，包括細(xì)胞分化、細(xì)胞生長、肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)育、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)、骨骼肌器官發(fā)育、外部刺激反應(yīng)、cAMP反應(yīng)等眾多生物學(xué)過程，見表2。差異基因功能GO分析結(jié)果也顯示，這些基因能參與18種細(xì)胞組分，且所有FDR < 0.05，其包括肌原纖維、肌節(jié)、細(xì)胞外空間、T小管、肌漿網(wǎng)膜、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等多種復(fù)雜細(xì)胞組分，見表3。

同時能參與蛋白質(zhì)結(jié)合分子功能，見表4。

2.3 差異基因KEGG信號通路分析 將490個差異基因?qū)隓AVID 6.7數(shù)據(jù)庫中并進(jìn)行KEGG信號通路分析，結(jié)果顯示，這些差異基因共參與6條信號通路（P < 0.05），其包括細(xì)胞外基質(zhì)受體互作、近端腎小管重吸收碳酸氫鹽、胃酸分泌、催產(chǎn)素、環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶G、脂肪細(xì)胞因子信號通路，見表5。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將490個差異基因?qū)隨tring-db數(shù)據(jù)庫獲得蛋白間相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)圖共340個節(jié)點(diǎn)（靶點(diǎn)蛋白）和370邊（蛋白相互作用），并以度值（Degree）≥10作為關(guān)鍵靶基因篩選的標(biāo)準(zhǔn)（節(jié)點(diǎn)的度值大小表示該節(jié)點(diǎn)所能互相作用的蛋白數(shù)）。利用Cytoscape 3.6.1軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的關(guān)鍵靶基因進(jìn)行篩選，共篩選出13個關(guān)鍵靶基因，其包括FOS、SMARCA4、SOCS3、LEP、FBXO32、MYOD1、TRIM63、SMARCA2、CALB1、MAPK12、ADIPOQ、TTN、EGR1。

3 討 論

OA屬于一種全關(guān)節(jié)疾病，是肥胖、創(chuàng)傷、年齡等多種因素共同作用的結(jié)果，除了影響關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)功能，還影響滑膜、韌帶、肌肉等其他關(guān)節(jié)組織的完整性[4]?；儆诟采w在關(guān)節(jié)囊內(nèi)側(cè)面的一層薄又柔軟的結(jié)締組織，其不僅能分泌滑液減少關(guān)節(jié)表面的摩擦力，而且也能為關(guān)節(jié)軟骨提供所需的營養(yǎng)成分，有利于維持關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性和靈活性。但當(dāng)滑膜受到創(chuàng)傷、感染、勞損等刺激時，能夠引起滑膜炎并分泌炎癥介質(zhì)，引起軟骨基質(zhì)的降解，加速OA的病理進(jìn)程[5]。炎性細(xì)胞侵入、滑膜細(xì)胞增生、血管新生增加等是滑膜炎主要病理特征?；ぱ滓彩且餙A關(guān)節(jié)紅腫熱痛及功能受損的一個重要原因[6]。因此，本研究從GEO數(shù)據(jù)庫下載關(guān)節(jié)滑膜基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)，并對其處理分析，旨在尋找出從滑膜方面治療OA的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為OA的治療提供新理論依據(jù)。

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫下載關(guān)節(jié)滑膜基因芯片數(shù)據(jù)GSE82107，并分為正常組和模型組，利用GEO2R在線對其處理分析。接著以P < 0.05和|logFC|≥2為差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)，共獲得差異基因490個，其中上調(diào)基因61個，下調(diào)基因429個。這也說明了OA發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，其并不是簡單的某個基因單獨(dú)起作用，而是眾多基因相互作用的結(jié)果。為了進(jìn)一步揭示這些差異基因在OA中扮演的角色，筆者對這些異同基因進(jìn)行功能GO分析和KEGG信號通路分析?；蚬δ蹽O分析結(jié)果顯示，這些差異基因主要參與細(xì)胞分化、細(xì)胞生長、肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)育、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)、骨骼肌器官發(fā)育、外部刺激反應(yīng)、cAMP反應(yīng)等眾多生物學(xué)過程;主要參與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合分子功能;主要參與能肌原纖維、肌節(jié)、細(xì)胞外空間、T小管、肌漿網(wǎng)膜、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等多種復(fù)雜細(xì)胞組件中。KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，這些差異基因主要涉及細(xì)胞外基質(zhì)受體互作、近端腎小管重吸收碳酸氫鹽、胃酸分泌、催產(chǎn)素、環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶G、脂肪細(xì)胞因子信號通路。細(xì)胞外基質(zhì)受體互作信號通路與OA炎癥反應(yīng)有著密切關(guān)聯(lián)[7]。催產(chǎn)素信號通路能通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶抑制軟骨基質(zhì)的降解[8]。環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶G信號通路能夠調(diào)控軟骨細(xì)胞功能[9]。脂肪細(xì)胞因子信號通路能通過調(diào)控眾多脂肪因子影響機(jī)體脂肪組織功能障礙，并進(jìn)一步加重OA的病理狀態(tài)[10]。而近端腎小管重吸收碳酸氫鹽和胃酸分泌2條信號通路與OA之間的研究報道甚少。

利用String-db數(shù)據(jù)庫對這些差異基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，其中位于中心的關(guān)鍵靶基因有FOS、SOCS3、LEP、FBXO32、MYOD1、TRIM63、TTN、CALB1、MAPK12、ADIPOQ、EGR1、SMARCA4、SMARCA2。FOS類似于核轉(zhuǎn)錄因子，其能通過調(diào)控細(xì)胞的分化、生長、分裂、增殖及凋亡等過程，從而改變眾多生命活動及過程。當(dāng)FOS表達(dá)降低時，有利于減少OA關(guān)節(jié)炎癥因子的分泌，緩解關(guān)節(jié)的疼痛[11]。SOCS能通過抑制JAK/STAT途徑減少炎癥因子表達(dá)[12]。SOCS3能夠抑制OA關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，同時也能夠負(fù)反饋調(diào)節(jié)IL-6信號通路[13-14]。LEP屬于一種小的非糖基化肽激素，由肥胖基因編碼而成[15]。LEP不僅可調(diào)節(jié)食物攝入量及能量消耗，而且能參與軟骨基質(zhì)代謝、軟骨修復(fù)、細(xì)胞增殖等其他生理過程[16]。肥胖人群的OA發(fā)病率顯著提高，這并不是單一由于加重關(guān)節(jié)負(fù)荷所致，LEP在OA與肥胖之間有著潛在聯(lián)系[17]。因此，LEP是一個極有潛力能成為OA癥狀診斷的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。FBXO32作為一種很有潛力的抑癌癥基因，廣泛存在于機(jī)體的各個組織中[18]。在OA關(guān)節(jié)軟骨和體外白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)FBXO32表達(dá)明顯升高[19]。肌肉萎縮、肌力下降及肌肉減少是關(guān)節(jié)退變在骨骼肌組織上的一個主要表現(xiàn)[20]。MYOD1、TRIM63在骨骼肌損傷后的修復(fù)過程中起著重要調(diào)節(jié)作用[21-22]。TTN也具有維持骨骼肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能正常作用[23]。CALB1與多種退行性疾病有關(guān)[24]，但目前尚無CALB1與OA的具體研究。MAPK信號通路不僅可以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨分泌炎癥因子，加速軟骨基質(zhì)降解，還能參與軟骨細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生命過程的調(diào)控[25-26]。而MAPK12是MAPK家族重要成員之一，其與骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲有著密切聯(lián)系[27]。ADIPOQ是脂肪細(xì)胞因子家族成員之一，對維持關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有著重要作用[28]。在OA關(guān)節(jié)軟骨中EGR1的表達(dá)明顯提高，且通過下調(diào)EGR1能抑制IL-1β介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變[29]。SMARCA2、SMARCA在染色質(zhì)重塑、DNA修復(fù)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中都起著關(guān)鍵調(diào)控作用[30]，但目前尚無SMARCA2、SMARCA4與OA之間的具體研究。

本研究通過生物信息學(xué)方法對正常人與OA患者滑膜中差異基因進(jìn)行分析，結(jié)果說明多個靶點(diǎn)、多條信號通路參與OA的形成。同時筆者也從PPI網(wǎng)絡(luò)圖中篩選出13個關(guān)鍵靶基因，其中FOS、SOCS3、LEP、FBXO32、MYOD1、TRIM63、TTN、MAPK12、ADIPOQ、EGR1在OA已經(jīng)有較多研究，CALB1、SMARCA4、SMARCA2在OA雖未被研究報道，但也有可能是治療OA的潛在靶點(diǎn)，有待進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

[1] JONSSON H.Following the genetic clues towards treatment of hand OA[J].Nat Rev Rheumatol，2018，14（Suppl1）：503-504.

[2] SI HB，ZENG Y，LIU SY，et al.Intra-articular injection of microRNA-140（miRNA-140）alleviates osteoarthritis（OA）progression by modulating extracellular matrix（ECM）homeostasis in rats[J].Osteoarthritis Cartilage，2017，25（10）：1698-1707.

[3] 韋尼，陳自佳，李蘇茜，等.蠟藥療聯(lián)合美洛昔康治療膝骨關(guān)節(jié)炎性滑膜炎36例臨床觀察[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2018，7（1）：18-22.

[4] 楊威，康武林，袁普衛(wèi)，等.滑膜炎在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中作用的研究進(jìn)展[J].中國康復(fù)理論與實踐，2015，21（5）：530-533.

[5] DE HAIR MJ，LECLERC P，NEWSUM EC，et al.Expression of Prostaglandin E2 Enzymes in the Synovium of Arthralgia Patients at Risk of Developing Rheumatoid Arthritis and in Early Arthritis Patients[J].PLoS One，2015，10（7）：e133669.

[6] BRATUS-NEUENSCHWANDER A，CASTRO-GINER F，F(xiàn)RANK-BERTONCELJ M，et al.Pain-Associated Transcriptome Changes in Synovium of Knee Osteoarthritis Patients[J].Genes（Basel），2018，9（7）：e338.

[7] LUO H，YAO L，ZHANG Y，et al.Liquid chromatography-mass spectrometry-based quantitative proteomics analysis reveals chondroprotective effects of astragaloside Ⅳ in interleukin-1beta-induced SW1353 chondro-cyte-like cells[J].Biomed Pharmacother，2017（91）：796-802.

[8] WU Y，WU T，XU B，et al.Oxytocin prevents cartilage matrix destruction via regulating matrix metalloproteinases[J].Biochem Biophys Res Commun，2017，486（3）：601-606.

[9] REN YM，ZHAO X，YANG T，et al.Exploring the Key Genes and Pathways of Osteoarthritis in Knee Cartilage in a Rat Model Using Gene Expression Profiling[J].Yonsei Med J，2018，59（6）：760-768.

[10] HOUARD X，GOLDRING MB，BERENBAUM F.Homeostatic mechanisms in articular cartilage and role of inflammation in osteoarthritis[J].Curr Rheumatol Rep，2013，15（11）：375.

[11] ORITA S，ISHIKAWA T，MIYAGI M，et al.Percutaneously absorbed NSAIDs attenuate local production of proinflammatory cytokines and suppress the expression of c-Fos in the spinal cord of a rodent model of knee osteoarthritis[J].J Orthop Sci，2012，17（1）：77-86.

[12] 孫曉輝.細(xì)胞因子信號抑制因子在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞的表達(dá)[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2013，29（2）：186-189.

[13] KOSKINEN-KOLASA A，VUOLTEENAHO K，KORHONEN R，et al.Catabolic and proinflammatory effects of leptin in chondrocytes are regulated by suppressor of cytokine signaling-3[J].Arthritis Res Ther，2016，18（1）：215.

[14] GUI T，HE BS，GAN Q，et al.Enhanced SOCS3 in osteoarthiritis may limit both proliferation and inflammation[J].Biotech Histochem，2017，92（2）：107-114.

[15] 陳亮，劉玉杰，魏民.瘦素對骨關(guān)節(jié)炎影響的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2017，22（5）：993-996.

[16] SCOTECE M，MOBASHERI A.Leptin in osteoarthritis：Focus on articular cartilage and chondrocytes[J].Life Sci，2015（140）：75-78.

[17] VUOLTEENAHO K，KOSKINEN A，MOILANEN E.Leptin-a link between obesity and osteoarthritis.applications for prevention and treatment[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol，2014，114（1）：103-108.

[18] SUKARI A，MUQBIL I，MOHAMMAD RM，et al.F-BOX proteins in cancer cachexia and muscle wasting：Emerging regulators and therapeutic opportunities[J].Semin Cancer Biol，2016（36）：95-104.

[19] KIM HE，RHEE J，PARK S，et al.Upregulation of Atrogin-1/FBXO32 is not necessary for cartilage destruction in mouse models of osteoarthritis[J].Osteoarthritis Cartilage，2017，25（3）：397-400.

[20] LEVINGER P，CALDOW MK，BARTLETT JR，et al.The level of FoxO1 and IL-15 in skeletal muscle，serum and synovial fluid in people with knee osteoarthritis：a case control study[J].Osteoporos Int，2016，27（6）：2137-2143.

[21] YADEN BC，WANG YX，WILSON JM，et al.Inhibition of activin A ameliorates skeletal muscle injury and rescues contractile properties by inducing efficient remodeling in female mice[J].Am J Pathol，2014，184（4）：1152-1166.

[22] NARASIMHAN M，HONG J，ATIENO N，et al.Nrf2 deficiency promotes apoptosis and impairs PAX7/MyoD expression in aging skeletal muscle cells[J].Free Radic Biol Med，2014（71）：402-414.

[23] 李俊平，徐玉明，方衛(wèi)斌.低氧環(huán)境與低氧運(yùn)動對骨骼肌Titin和Nebulin含量的影響[J].北京體育大學(xué)學(xué)報，2010，45（1）：42-44.

[24] 何蓮子，鄧媛媛，高健美，等.鈣結(jié)合蛋白-D28K在神經(jīng)退行性疾病中的作用[J].中國新藥與臨床雜志，2017，36（5）：254-258.

[25] GAO SC，YIN HB，LIU HX，et al.Research progress on MAPK signal pathway in the pathogenesis of osteoarthritis[J].Zhongguo Gu Shang，2014，27（5）：441-444.

[26] SHI J，ZHANG C，YI Z，et al.Explore the variation of MMP3，JNK，p38 MAPKs，and autophagy at the early stage of osteoarthritis[J].IUBMB Life，2016，68（4）：293-302.

[27] CUI C，SHI X.miR-187 inhibits tumor growth and invasion by directly targeting MAPK12 in osteosarcoma[J].Exp Ther Med，2017，14（2）：1045-1050.

[28] HAMALAINEN S，SOLOVIEVA S，VEHMAS T，et al.Adipokine genes and radiographic hand osteoarthritis in Finnish women：a cross-sectional study[J].Scand J Rheumatol，2018，47（1）：71-78.

[29] NEBBAKI SS，EL MF，AFIF H，et al.Egr-1 contributes to IL-1-mediated down-regulation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma expression in human osteoarthritic chondrocytes[J].Arthritis Res Ther，2012，14（2）：R69.

[30] AYDIN ?Z，VERMEULEN W，LANS H.ISWI chromatin remodeling complexes in the DNA damage response[J].Cell Cycle，2014，13（19）：3016-3025.

收稿日期：2018-10-21;修回日期：2018-12-21