王 超， 朱麗巖， 卜亞謙， 董輝輝， 王 騰， 陳 香

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

四溴雙酚A(TBBPA)是產(chǎn)量最高的溴系阻燃劑，約占據(jù)了全球阻燃劑市場(chǎng)的60%，被廣泛用于各類型工業(yè)品和消費(fèi)品生產(chǎn)中[1-3]。四溴雙酚A及其衍生物可通過正常的生產(chǎn)、使用和處置等途徑進(jìn)入環(huán)境中[1]。目前在世界各地(包括北極地區(qū)[4])的空氣、灰塵、土壤、水、沉積物和生物樣本，甚至是人體組織樣本中均檢測(cè)到TBBPA的存在[5]，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將其劃為2A級(jí)可能致癌物[6]。已有研究表明：TBBPA具有生殖毒性，濃度高于1.5 mol/L便能導(dǎo)致斑馬魚早熟卵母細(xì)胞增多，產(chǎn)卵率、孵化率和仔魚成活率下降[7]；TBBPA具有甲狀腺干擾效應(yīng)，能引起大鼠甲狀腺動(dòng)態(tài)失衡對(duì)其內(nèi)分泌產(chǎn)生干擾[8]；TBBPA具有細(xì)胞毒性，能干擾哺乳動(dòng)物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使細(xì)胞存活率顯著降低[9]，甚至能通過誘導(dǎo)組織產(chǎn)生活性氧而引起水生生物的氧化脅迫[10]。此外，TBBPA還具有神經(jīng)毒性、免疫毒性、雌激素干擾效應(yīng)等[11]。TBBPA作為一種持久性的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，將會(huì)對(duì)長(zhǎng)期暴露其中的有機(jī)體造成不可忽視的危害。

橈足類是海洋浮游動(dòng)物類群的重要組成部分，對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)起著承上啟下的關(guān)鍵作用。橈足類體型小、生活史短、繁殖能力強(qiáng)，是理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ缴?。其中日本虎斑猛水蚤在我?guó)近海及潮間帶分布廣泛，性別差異明顯，為雜食性動(dòng)物，且對(duì)環(huán)境波動(dòng)耐受性較強(qiáng)，比其他橈足類更易于在實(shí)驗(yàn)室存活，利于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室馴化培養(yǎng)[12]。

當(dāng)前的TBBPA毒性研究主要集中于魚類或嚙齒類動(dòng)物，對(duì)橈足類的生殖毒性報(bào)道相對(duì)較少，因此本研究選取日本虎斑猛水蚤為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，運(yùn)用實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)方法、組織切片技術(shù)和透射電子顯微鏡技術(shù)，觀察了TBBPA暴露下其生殖指標(biāo)、卵巢組織結(jié)構(gòu)和卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，旨在個(gè)體、組織和細(xì)胞三個(gè)層面探討TBBPA對(duì)日本虎斑猛水蚤生殖的影響，為進(jìn)一步了解TBBPA的生殖毒性提供了參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

日本虎斑猛水蚤采自青島匯泉灣附近海域，已在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)馴化培養(yǎng)3 a以上，培養(yǎng)條件：溫度20 ℃、鹽度30、光照12 h (L) : 12 h (D)。海水經(jīng) 0.45 μm的微孔濾膜過濾并充分曝氣后使用。實(shí)驗(yàn)餌料為5 × 104cells/ml青島大扁藻(Platymonashelgolandica)、5×104cells/ml三角褐指藻(PhaeodactylumtricornutumBohlin)和酵母(Saccharomycescerevisiae；Anqi?，hina)2∶2∶1 的混合液。

TBBPA固體購(gòu)自J&K化學(xué)試劑有限公司，以二甲亞砜(DMSO)作為助溶劑，配制濃度為10 g/L的母液，并用過濾海水將其稀釋至50 mg/L備用。各實(shí)驗(yàn)組中DMSO所占比例均不超過0.005%[13]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法[12-14]

本實(shí)驗(yàn)室的急性毒性實(shí)驗(yàn)測(cè)得TBBPA對(duì)日本虎斑猛水蚤48h-LC50為4.423 mg/L，急性實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件同上述馴化培養(yǎng)條件。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)48h-LC50值，設(shè)定4個(gè)TBBPA濃度組(分別為55.29、110.58、221.15、442.30 μg/L)和溶劑對(duì)照組(DMSO含量與最高濃度組助溶劑含量一致，為44 μL/L)，每實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行。將孵化24 h內(nèi)的無(wú)節(jié)幼蟲置于24孔板中，每板為一個(gè)平行組，實(shí)驗(yàn)條件同上。待其發(fā)育至橈足類幼體挑至6孔板中待雌體抱卵，各平行隨機(jī)挑選4只抱卵雌體，進(jìn)行自首次抱卵時(shí)間開始計(jì)數(shù)10 d內(nèi)的生殖情況觀察，記錄各項(xiàng)生殖指標(biāo)。每12 h觀察一次，24 h投餌并換水50%。

組織結(jié)構(gòu)觀察：經(jīng)TBBPA暴露20 d，在每個(gè)濃度組中隨機(jī)挑選首次抱卵的正常雌體各5只，于Bouin氏液固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度5 μm，H-E染色，Olympus BX53型顯微鏡拍照觀察。

超微結(jié)構(gòu)觀察：經(jīng)TBBPA暴露20 d，在每個(gè)濃度組中隨機(jī)挑選首次抱卵的正常雌體各5只，于1.5 mL離心管中，立即加入3%戊二醛，4 ℃條件下固定24 h后，用1%鋨酸進(jìn)行雙重固定，梯度丙酮脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋。包埋后的樣品于LKBV超薄切片機(jī)在橈足類體長(zhǎng)1/2處切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，日立H-700型透射電鏡觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD多重比較分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 TBBPA對(duì)日本虎斑猛水蚤生殖指標(biāo)的影響

2.1.1 TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的首次抱卵時(shí)間 由圖1知：對(duì)照組首次抱卵時(shí)間為17.16 d，由低濃度到高濃度，各組抱卵時(shí)間分別為17.99、18.28、18.84和19.23 d，與對(duì)照組相比，首次抱卵時(shí)間均受到一定程度延遲，其中221.15 μg·L-1TBBPA組差異顯著(P<0.05)，442.30 μg·L-1TBBPA組差異極顯著(P<0.01)。與對(duì)照相比，各濃度組變態(tài)時(shí)間均延遲，且442.30 μg·L-1TBBPA組差異顯著(P<0.05)；而各濃度組成熟時(shí)間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

(N-A：首次抱卵時(shí)間；N-C：無(wú)節(jié)幼蟲至橈足幼體的發(fā)育時(shí)間；C-A：橈足幼體至成體抱卵的成熟時(shí)間。N-A: the first spawning time, N-C: the nauplius phase, C-A: the copepodids phase.Note: *P<0.05 ,**P<0.01. )

圖1 不同濃度TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的首次抱卵時(shí)間
Fig.1 The first spawning time ofT.japonicusexposed to TBBPA

2.1.2 TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的性別比 對(duì)照組日本虎斑猛水蚤性別比(雌/雄)為0.73，雄性個(gè)體占優(yōu)勢(shì)，而各TBBPA濃度組性別比分別為0.59、1.32、1.29、1.23。與對(duì)照組相比，中高濃組日本虎斑猛水蚤性別比升高，差異顯著(見圖2)。

(* P<0.05 , ** P<0.01)圖2 不同濃度TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的性別比Fig.2 The sex ratio of T. japonicus exposed to TBBPA

2.1.3 TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的卵囊發(fā)育時(shí)間，抱卵次數(shù)和產(chǎn)卵量 不同濃度TBBPA暴露下，自日本虎斑猛水蚤首次抱卵時(shí)間開始計(jì)數(shù)10天內(nèi)，各濃度組抱卵次數(shù)和卵囊發(fā)育時(shí)間，與對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。就生殖力而言，對(duì)照組日本虎斑猛水蚤產(chǎn)卵量為74.44 eggs·female-1，而55.29 μg·L-1TBBPA組雌體生殖力顯著升高(P<0.05)，為98.67 eggs·female-1，其余各組生殖力均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(見表1)。

表1 不同濃度TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的 卵囊發(fā)育時(shí)間、抱卵次數(shù)及產(chǎn)卵量Table1 The oocyst development time, number of clutches and fecundity of T. japonicus measured over 10 days

Note: *P<0.05.

2.2 TBBPA對(duì)日本虎斑猛水蚤卵巢組織結(jié)構(gòu)和卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的卵巢組織結(jié)構(gòu) 對(duì)日本虎斑猛水蚤卵巢的組織切片觀察發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組日本虎斑猛水蚤卵巢中，卵母細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞排列緊密；細(xì)胞質(zhì)分布均勻；細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，核膜清晰，卵黃合成位點(diǎn)圍繞細(xì)胞核分布、清晰可見。與對(duì)照相比，各TBBPA組中卵巢組織結(jié)構(gòu)良好，未見顯著異常現(xiàn)象(見圖3)。

2.2.2 TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 日本虎斑猛水蚤卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)如圖4所示。對(duì)照組中，卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體和卵黃顆粒結(jié)構(gòu)完整，且數(shù)量較多。與對(duì)照組相比，55.29 μg·L-1組中，日本虎斑猛水蚤卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)完整，無(wú)顯著差異。110.58 μg·L-1組中，卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體和卵黃結(jié)構(gòu)基本完整，較少部分線粒體內(nèi)嵴斷裂。221.15 μg·L-1組中，線粒體內(nèi)嵴斷裂溶解增加，個(gè)別線粒體囊泡化；少部分卵黃膜溶解、卵黃顆粒皺縮變形。442.30 μg·L-1組中，卵母細(xì)胞內(nèi)囊泡化線粒體比例增加，少數(shù)線粒體膜溶解導(dǎo)致線粒體解體；部分卵黃顆粒的卵黃膜溶解，此外卵黃數(shù)量較少且多為未發(fā)育完全的初級(jí)卵黃。

3 討論

3.1 TBBPA對(duì)日本虎斑猛水蚤生殖指標(biāo)的影響

橈足類從無(wú)節(jié)幼蟲發(fā)育至成體首次抱卵的時(shí)間段稱為首次抱卵時(shí)間。TBBPA暴露條件下，日本虎斑猛水蚤的首次抱卵時(shí)間顯著延長(zhǎng)，這可能是橈足類個(gè)體在應(yīng)對(duì)不良環(huán)境時(shí)，自身能量收支失衡，用于生長(zhǎng)發(fā)育的生物能減少造成的。有研究表明，TBBPA會(huì)影響橈足類的攝食、耗氧和排氨等生命活動(dòng)，導(dǎo)致能量收支失衡[13-14]。橈足類雌體在首次抱卵前需經(jīng)歷變態(tài)發(fā)育(N-C)和性成熟發(fā)育(C-A)兩個(gè)階段。Marcial等[15]發(fā)現(xiàn)，日本虎斑猛水蚤的變態(tài)期和成熟期對(duì)雙酚A等雌激素干擾物的影響最敏感。由結(jié)果可知，本研究中日本虎斑猛水蚤變態(tài)期發(fā)育比成熟期發(fā)育更容易受到TBBPA影響而顯著延遲。Lee等[16]測(cè)定了9種污染物對(duì)日本虎斑猛水蚤不同生命指標(biāo)的影響，亦發(fā)現(xiàn)變態(tài)時(shí)間和成熟時(shí)間敏感性較高，且變態(tài)時(shí)間更為敏感。因此推測(cè)，日本虎斑猛水蚤首次抱卵時(shí)間的延長(zhǎng)，主要是無(wú)節(jié)幼蟲變態(tài)發(fā)育期受到脅迫延長(zhǎng)，使橈足類個(gè)體性成熟同步性降低影響交配所致。

(a. 對(duì)照；b.55.29 μg·L-1；c.110.58 μg·L-1；d.221.15 μg·L-1；e.442.30 μg·L-1；oog. 卵原細(xì)胞；ooc. 卵母細(xì)胞；比例尺=50 μm。 a. control；b.cTBBPA55.29 μg·L-1；c.cTBBPA110.58 μg·L-1；d.cTBBPA221.15 μg·L-1；e.cTBBPA442.30 μg·L-1；oog. Oognium；ooc. Oocyte；Bar =50 μm.)

圖3 不同濃度TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的卵巢組織結(jié)構(gòu)
Fig.3 The histological structure of ovary inT.japonicusexposed to TBBPA

(a.對(duì)照；b.55.29 μg·L-1；c.110.58 μg·L-1；d.221.15 μg·L-1；e. 442.30 μg·L-1；M. 線粒體；Y. 卵黃顆粒；N. 細(xì)胞核；比例尺=1 μm。a. control; b.cTBBPA=55.29 μg·L-1; c.cTBBPA=110.58 μg·L-1; d.cTBBPA=221.15 μg·L-1;e.cTBBPA=442.30 μg·L-1; M. Mitochondrion; Y. Yolk granule; N. Nucleus; Bar =1 μm. )

圖4 不同濃度TBBPA暴露下日本 虎斑猛水蚤卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)
Fig.4 The oocyte ultrastructure ofT.japonicusexposed to TBBPA

經(jīng)不同濃度TBBPA暴露后，中高濃度組日本虎斑猛水蚤性別比顯著升高，傾向雌性化。這可能有兩個(gè)原因：一方面，大量研究表明暴露于脅迫條件中的橈足類，由于雌體承擔(dān)了繁殖后代的責(zé)任，其耐受力高于雄性[17-19]。因此，日本虎斑猛水蚤雄性個(gè)體可能對(duì)TBBPA的毒性更敏感，更容易受到脅迫死亡，死亡率的性別差異導(dǎo)致性別比例失調(diào)[19]。另一方面，甲殼動(dòng)物在孵化期間無(wú)法鑒定其幼蟲性別，只有經(jīng)過幼蟲的連續(xù)蛻皮后，性別特征才能發(fā)育。Ylenia C等[20]也曾指出，一些哲水蚤種在CⅠ期間就已經(jīng)出現(xiàn)性腺，但其性別分化直到CⅣ期才開始，且雄性第二特征只受雄性激素的控制[21]，任何干擾雄性激素的因素都能阻礙雄性的分化。TBBPA具有弱的雌激素作用，因此可能在一定程度上擾亂了性別分化。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，TBBPA終會(huì)也對(duì)橈足類雌體造成不可逆的傷害，從而不利于種群的發(fā)展。

TBBPA作用下，日本虎斑猛水蚤的卵囊發(fā)育時(shí)間有縮短的趨勢(shì)。鞏文靜[13]的研究中也發(fā)現(xiàn)，18μg/L濃度的TBBPA便能顯著促進(jìn)指狀偽鏢水蚤卵囊成熟，縮短卵囊發(fā)育時(shí)間。Feng G[22]等研究了PCB126對(duì)日本虎斑猛水蚤的慢性毒性影響，發(fā)現(xiàn)F0代雌體超過12 d的抱卵次數(shù)均無(wú)顯著差異。本研究中，各濃度組抱卵次數(shù)亦無(wú)顯著差異。而經(jīng)TBBPA暴露后，各濃度組日本虎斑猛水蚤的生殖力均不同程度升高，55.29 μg·L-1TBBPA組差異顯著。有研究表明，生物體為了適應(yīng)逆境，會(huì)對(duì)能量進(jìn)行收支權(quán)衡[23]，增加生殖量以掩蓋死亡率，維持種群穩(wěn)定[24]。由此推測(cè)，日本虎斑猛水蚤分配了更多的能量用于生殖來(lái)抵抗不良環(huán)境的脅迫，維持種群穩(wěn)定，生殖力的升高彌補(bǔ)了發(fā)育的延遲。此外，較低濃度污染物可刺激橈足類攝食增加、代謝速度加快[25]，引起產(chǎn)卵率增高[26]，因此低濃度組生殖力顯著升高。目前，TBBPA對(duì)橈足類生殖的慢性毒性研究還相對(duì)較少，尤其是低劑量長(zhǎng)期暴露條件下的影響，可通過多世代暴露研究TBBPA的生殖毒性機(jī)制及生物蓄積毒性。

3.2 TBBPA暴露條件下日本虎斑猛水蚤卵巢組織結(jié)構(gòu)的變化

性腺的質(zhì)量對(duì)生物體的繁殖至關(guān)重要[27]，然而環(huán)境中的多種內(nèi)分泌干擾物均能對(duì)橈足類的卵巢組織造成影響，如甲基睪丸素、來(lái)曲唑和氯化三苯基錫均能使湯氏紡錘水蚤的卵巢發(fā)生卵黃合成紊亂、卵細(xì)胞退化等組織學(xué)病變[28]。TBBPA同樣能對(duì)動(dòng)物的性腺造成影響，例如，經(jīng)TBBPA暴露后斑馬魚卵巢中的卵泡發(fā)育受到抑制，精巢損傷嚴(yán)重[29]。不同的是，本研究中，各濃度組日本虎斑猛水蚤的卵巢組織結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，這可能是取材時(shí)間較早導(dǎo)致。因?yàn)橛糜诮M織切片的樣本均為首次抱卵24 h內(nèi)的雌體，該暴露時(shí)間或許還不足以使得TBBPA的負(fù)面影響在組織層面呈現(xiàn)，但推測(cè)日本虎斑猛水蚤卵細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)已有顯著變化。另外，楊蘇文等[30]指出相同濃度的TBBPA在組織層次上對(duì)鯽魚的卵巢無(wú)顯著影響，而雄性個(gè)體更容易受到毒害，精巢明顯受損。本研究未對(duì)雄性個(gè)體的性腺進(jìn)行組織切片觀察，因此有必要進(jìn)一步研究相同濃度TBBPA對(duì)雄性日本虎斑猛水蚤精巢組織的影響。

3.3 TBBPA暴露條件下日本虎斑猛水蚤卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

結(jié)果顯示，卵母細(xì)胞中出現(xiàn)線粒體和卵黃膜結(jié)構(gòu)的溶解，卵黃顆粒發(fā)育滯后等變化，這表明TBBPA能對(duì)日本虎斑猛水蚤卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)造成損傷，阻礙卵細(xì)胞的發(fā)育。

對(duì)甲殼動(dòng)物而言，卵母細(xì)胞中的線粒體主要功能是維持呼吸代謝，為卵黃發(fā)生等生理過程提供所需的能量，還直接參與內(nèi)源性卵黃的形成[31-32 ]。TBBPA暴露下，部分線粒體膜結(jié)構(gòu)斷裂溶解、出現(xiàn)囊泡化、甚至解體，這可能會(huì)阻斷卵母細(xì)胞的能量供應(yīng)，阻礙卵黃發(fā)生過程。卵黃顆粒是卵母細(xì)胞中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)備的場(chǎng)所，為胚胎的發(fā)育提供物質(zhì)和能源，其數(shù)量、分布及組分等不僅直接影響卵子的成熟和質(zhì)量，還會(huì)對(duì)后續(xù)胚胎發(fā)育造成影響[32-33]。TBBPA暴露下，較高濃度組卵黃顆粒數(shù)量略微減少且部分卵黃處于初級(jí)階段，這說明TBBPA在一定程度上抑制了卵黃合成，卵黃發(fā)育滯后。此外個(gè)別卵黃顆粒皺縮變形、卵黃膜溶解，這將直接導(dǎo)致卵黃質(zhì)量下降，進(jìn)而阻礙卵母細(xì)胞的發(fā)育，甚至造成子代胚胎發(fā)育滯后或停止。但在卵巢組織和個(gè)體生殖層次并未表現(xiàn)出相應(yīng)的脅迫效應(yīng)，這可能因?yàn)槁涯讣?xì)胞中受損超微結(jié)構(gòu)所占比例相對(duì)較小，不足以引起整體的顯著變化。

TBBPA會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[34-37]，日本虎斑猛水蚤卵母細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的溶解，卵黃顆?；蔚龋羌?xì)胞凋亡的表現(xiàn)。研究表明，一方面，TBBPA可通過線粒體去極化及Ca2+信號(hào)失調(diào)使細(xì)胞凋亡[34]，另一方面，脅迫條件可造成橈足類個(gè)體氧化損傷，體內(nèi)的活性氧也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[31]。因此，研究TBBPA作用下線粒體、Ca2+和活性氧如何協(xié)作誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)了解TBBPA的細(xì)胞毒性及生殖毒性具有重要意義。

綜上可知，經(jīng)TBBPA單世代暴露，日本虎斑猛水蚤的個(gè)體繁殖指標(biāo)(首次抱卵時(shí)間、性別比和生殖力)和卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)均受到了顯著影響，本研究為評(píng)估TBBPA對(duì)海洋生物的毒性效應(yīng)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。為了更全面的了解TBBPA的生殖毒性，需進(jìn)一步在分子層面研究TBBPA的作用機(jī)制。