李 超，其日格日，趙啟南，烏英嘎，康德措，趙一萍，格日樂其木格，芒 來

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬屬動(dòng)物遺傳育種與繁殖科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬屬動(dòng)物研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

在生物氧化的電子傳遞過程中，細(xì)胞色素C氧化酶4（COX4）是電子傳遞鏈上復(fù)合體4的1個(gè)關(guān)鍵亞基，它由COX4基因編碼，主要功能把呼吸底物的電子經(jīng)過細(xì)胞色素系統(tǒng)直接傳遞給分子態(tài)氧[1]。研究表明，COX4蛋白共有2個(gè)異構(gòu)體，即COX4I1和COX4I2，兩者在體內(nèi)起到相反作用。在缺氧條件下COX4I1基因的表達(dá)被COX4I2基因所抑制，而在有氧條件下COX4I1基因率先表達(dá)[2]。膜脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPpm）是由FABPpm基因編碼了分子量為43 ku的FABPpm膜蛋白，主要定位在細(xì)胞質(zhì)膜和線粒體膜上。Glatz等[3]指出，脂肪酸跨膜運(yùn)輸?shù)幕具^程是脂肪酸先與白蛋白形成復(fù)合體，再與質(zhì)膜上的白蛋白形成結(jié)合白蛋白，最后脂肪酸被釋放并被FABPpm蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)。因此，認(rèn)為FABPpm的表達(dá)水平與脂肪酸代謝水平密切相關(guān)。小窩是位于細(xì)胞膜上的頸狀凹陷囊泡結(jié)構(gòu)，小窩蛋白-1（CAV-1）是小窩主要結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)節(jié)成分。CAV-1的α和β亞基均能結(jié)合脂肪酸，斷定CAV-1是一種脂肪酸結(jié)合蛋白[4]，其主要作為脂筏的組成蛋白，并以脂筏為平臺(tái)直接結(jié)合游離脂肪酸，參與脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[5]。綜上，COX4I2、FABPpm和CAV-1基因在分別在與高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)相關(guān)生物氧化過程和脂肪酸分解過程中發(fā)揮了重要作用。

蒙古馬作為耐力運(yùn)動(dòng)能力較為出色的馬種，在高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中ATP的合成及脂肪酸的分解過程都極為重要。但以上3種基因在蒙古馬中的研究較為少見，尤其是在高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后基因表達(dá)量差異的研究還未見報(bào)道。本研究選取蒙古馬臀中肌中與運(yùn)動(dòng)有關(guān)的3個(gè)基因（COX4I2、FABPpm和CAV-1）作為候選基因，檢測(cè)高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后轉(zhuǎn)錄水平mRNA的表達(dá)量，為今后馬運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與基因表達(dá)相關(guān)方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和訓(xùn)練方法 實(shí)驗(yàn)選擇3匹5歲雌性蒙古馬，高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)前，空腹?fàn)顟B(tài)下將馬匹麻醉后從臀中肌中采集肌肉樣品（30 g），樣品離體后，蒸餾水洗凈并迅速剪成豆粒大小，放入已編號(hào)的無RNase Ep管中（Eppendorf），并置于液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室放入-80℃冰箱（Eppendorf）中保存。

待馬匹得到充足休息后，開始進(jìn)行高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練在一個(gè)直徑30 m，周長(zhǎng)100 m的圓形調(diào)教圈中進(jìn)行。 訓(xùn)練期4個(gè)月，共計(jì)122 d，為避免運(yùn)動(dòng)損傷，訓(xùn)練計(jì)劃將分為3個(gè)階段，每階段分若干周期，逐步提高運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練強(qiáng)度。第1階段為第1～15天：此階段總計(jì)15 d，每5 d為1個(gè)周期，第1周期第1天運(yùn)動(dòng)8 km，第2～4天每日遞增2 km，第5天休息；第2和第3周期訓(xùn)練循環(huán)方式同第1周期。這個(gè)階段訓(xùn)練的主要目的是使肌腱、韌帶和骨骼能夠得到強(qiáng)化，幫助馬匹適應(yīng)后面的高強(qiáng)度訓(xùn)練。第2階段為第16～108天：此階段總計(jì)92 d，每4 d為1個(gè)周期，起始訓(xùn)練距離為15 km，每個(gè)周期中前3 d每日訓(xùn)練距離以5 km遞增，第4天休息，如此循環(huán)。此階段訓(xùn)練是為了使肌肉有氧適應(yīng)性最大化，距離逐步增加，并及時(shí)下降回歸，讓訓(xùn)練馬匹得到休息。使肌肉、心臟和肺臟等器官能夠適應(yīng)遞增的高強(qiáng)度運(yùn)。第3階段為第109～122天：此階段總計(jì)14 d，在這個(gè)階段要盡可能延長(zhǎng)訓(xùn)練時(shí)間和訓(xùn)練距離，起始訓(xùn)練距離為20 km，第2～4天訓(xùn)練距離以 10 km 遞增，第5、6天休息，該階段結(jié)束后，采取樣品，方法同1.1。

實(shí)驗(yàn)用馬在訓(xùn)練期間每天飼喂5次青干草，白天4次，夜間補(bǔ)飼1次，草量以半小時(shí)內(nèi)吃完無剩余為準(zhǔn)；每天飼喂 1 次精飼料，精飼料包括玉米、燕麥與麩皮，按照 4:4 :2 加水?dāng)嚢璩睗窈蠊┙o，隔天在精飼料中加入葵花籽和食用鹽。不限制飲水量，飲水經(jīng)常更換以保持新鮮；馬廄內(nèi)長(zhǎng)期掛鹽磚和糖磚供其自由舔舐，補(bǔ)充微量元素。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA的合成 首先，將凍存在-80℃的蒙古馬臀中肌肌肉樣品放入裝有液氮的研缽中，根據(jù)Trizol試劑（TaKaRa）總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)總RNA的完整性，微量紫外分光光度計(jì)（Thermo NANODROP 2000c）測(cè)定提取的總濃度。其次，使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行cDNA的合成，反應(yīng)體系：5×PrimeScript Buffer2 4.0 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix1 1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、RNase Free dH2O 4.0 μL、總RNA 10.0 μL，總反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件為37℃、15 min，85℃、5 s，溫度降到4℃時(shí)終止反應(yīng)，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在-20℃冰箱里保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 分別根據(jù)馬運(yùn)動(dòng)相關(guān)的文獻(xiàn)記錄[6]，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，NC_009149）基因?yàn)閮?nèi)參基因，并選取肌肉中與馬高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)相關(guān)的3個(gè)基因?yàn)楹蜻x基因，即COX4I2（NC_009165.3）、FABPpm（NC_009146.3）和CAV-1（NC_009147.3），使用Primer Premier 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，并且通過NCBI中的Blast功能，檢測(cè)各引物的特異性。設(shè)計(jì)完后由上海生物工程有限公司合成，具體引物信息見表1。

1.2.3 普通PCR 使用cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增基因的目的片段采用三步法PCR擴(kuò)增程序，95℃預(yù)變性5 min，98℃變性10 s，按各基因相應(yīng)的退火溫度（表1）退火30 s，72℃延伸1 min ，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 熒光定量PCR是采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa）在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Agilent Technolog-ies Strata gene Mx3000P，Agilent）上進(jìn)行。反應(yīng)體系總計(jì)20 μL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，cDNA模版2.0 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，ddH2O 6 μL。每個(gè)樣品重復(fù)3管。

1.3 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)采用 2-ΔΔCt（ΔCt=Ct目的基因—Ct內(nèi)參基因）并以GAPDH為內(nèi)參基因?qū)γ晒篷R肌肉中與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的3個(gè)基因進(jìn)行運(yùn)算和矯正。將得到的數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)，并利用GraphPad Prism 6進(jìn)行繪圖。

表1 引物序列參數(shù)

2 結(jié) 果

2.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA樣本呈完整清晰的28 S、18 S和5 S條帶（圖1-A），反轉(zhuǎn)錄后cDNA電泳圖見圖1-B。

圖1 蒙古馬臀中肌總RNA和反轉(zhuǎn)錄后cDNA

2.2 運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量 由圖2可知，高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后蒙古馬臀中肌中COX4I2、FABPpm和CAV-1基因表達(dá)量均存在升高趨勢(shì)，其中COX4I2和FABPpm差異顯著（P＜0.05），而CAV-1在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異并不顯著（P＞0.05）。

圖2 訓(xùn)練前后蒙古馬臀中肌中運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

近年來，關(guān)于COX4I2基因與運(yùn)動(dòng)關(guān)系的研究較多集中于人和小鼠以及純種馬上。COX4I2基因具有組織特異性，其在肌肉組織中的表達(dá)量顯著高于其他組織[7]。研究表明，對(duì)8匹未經(jīng)訓(xùn)練的純種馬進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的漸進(jìn)式踏車運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，COX4I2基因在肌肉中的表達(dá)量顯著高于運(yùn)動(dòng)前[8]。曹行[9]研究發(fā)現(xiàn)，伊犁馬的COX4I2基因存在遺傳多樣性，其不同的基因型對(duì)伊犁馬的運(yùn)動(dòng)能力有較大影響。因而，無論是COX4I2基因在肌肉組織中特異性高表達(dá)，還是通過運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練提高了COX4I2基因表達(dá)量，以及不同基因型對(duì)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力的影響都印證了COX4I2基因與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和能量代謝具有相關(guān)性，即COX4I2基因表達(dá)的增加為機(jī)體提供了更多的熱量來保持體溫及維持能量。本研究發(fā)現(xiàn)，在為期4個(gè)月的高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，蒙古馬臀中肌中COX4I2基因的表達(dá)量顯著提高。由此可見，通過長(zhǎng)期高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，能夠增強(qiáng)線粒體活性，提供運(yùn)動(dòng)所需的能量。

Talanian等[10]對(duì)10名女性進(jìn)行6周的高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練后，骨骼肌細(xì)胞內(nèi)FABPpm含量增加了48%。關(guān)于一次性力竭運(yùn)動(dòng)的研究表明，120 min的力竭運(yùn)動(dòng)可以使人類和大鼠質(zhì)膜上的FABPpm蛋白含量分別增加20%和30%[11]。這說明FABPpm基因表達(dá)的增強(qiáng)與運(yùn)動(dòng)具有很大的相關(guān)性，不同的運(yùn)動(dòng)方式對(duì)FABPpm表達(dá)影響都具有相同的趨勢(shì)，即FABPpm含量都增加；同時(shí)也可以看出，高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練相比一次性力竭運(yùn)動(dòng)有更大影響。在生物體內(nèi)，F(xiàn)ABPpm基因表達(dá)可以被腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated Protein Kinase，AMPK）激活，AMPK 信號(hào)通路是調(diào)控脂肪代謝的關(guān)鍵通路[12]。FABPpm表達(dá)的升高很有可能是由于肌肉運(yùn)動(dòng)刺激AMPK，而后AMPK刺激FABPpm表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)期高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后蒙古馬臀中肌中FABPpm基因表達(dá)有顯著提高，這與以前的研究[10-11]基本一致，即運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)了FABPpm基因在肌肉中的表達(dá)，因而長(zhǎng)期高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)在一定程度上能促進(jìn)機(jī)體中脂肪的代謝。

CAV-1與脂肪代謝有著密切的關(guān)系。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，CAV-1缺失的小鼠表現(xiàn)出明顯的代謝紊亂，并且脂代謝嚴(yán)重受阻[13]，這表明CAV-1與脂肪代謝有密切關(guān)系。張荷等[14]研究表明，低氧運(yùn)動(dòng)可以顯著增加大鼠肌肉中CAV-1蛋白含量，而在常氧的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下大鼠CAV-1蛋白含量雖有增加，但增加趨勢(shì)不顯著。Oh等[15]研究發(fā)現(xiàn)，抗阻訓(xùn)練運(yùn)動(dòng)后CAV-1基因的表達(dá)與小鼠的肌肉纖維類型有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蒙古馬高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后，CAV-1基因表達(dá)量升高，但不顯著。這可能是由于肌纖維類型差異所致，臀中肌中Ⅰ型、Ⅱa型和Ⅱx型肌纖維以不同比例存在；也可能由于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方式差異所致。

綜上所述，COX4I2、FABPpm和CAV-1基因與蒙古馬的運(yùn)動(dòng)能力存在密切關(guān)系，可為今后蒙古馬運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和相關(guān)基因的研究提供有價(jià)值的參考依據(jù)。