陳煒昊，田志龍，孫 偉，儲(chǔ)明星

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；3.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽 471003）

綿羊產(chǎn)羔性狀遺傳力只有0.05～0.15，常規(guī)育種手段難以滿足現(xiàn)代畜牧業(yè)對(duì)于產(chǎn)羔性狀改良的需求[1]。標(biāo)記輔助選擇能夠極大提高低遺傳力性狀（如綿羊產(chǎn)羔性狀）的選擇效率，而找到與產(chǎn)羔性狀位點(diǎn)相連鎖的標(biāo)記，則是實(shí)現(xiàn)標(biāo)記輔助選擇的基礎(chǔ)[2]。研究表明，綿羊?qū)儆诩竟?jié)性繁殖動(dòng)物，在光照逐漸縮短的秋冬季節(jié)開始性腺活動(dòng)，在冬春之交時(shí)結(jié)束[3]，季節(jié)性繁殖活動(dòng)主要受下丘腦—垂體—性腺軸（HPG）系統(tǒng)調(diào)控[4]，與生殖激素的變化密切相關(guān)。

基因組印記基因又稱遺傳印記基因，這類基因表達(dá)與否取決于它們所在染色體來源（父系或母系）以及在其來源染色體上該基因是否發(fā)生沉默[5]。研究表明，大多數(shù)印記基因可能是控制家畜生長(zhǎng)發(fā)育與繁殖的主效基因[6]。Makorin環(huán)指蛋白3（Makorin Ring Finger Protein 3，MKRN3）基因?yàn)楦副颈磉_(dá)、母本印記的印記基因，屬于M蛋白家族，因其在物種間保守性及在發(fā)育神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)，在細(xì)胞中扮演著極其重要的作用[7]。人MKRN3基因定位于染色體15q11.2上，位于Prader-Willi綜合征關(guān)鍵位置，該綜合征表現(xiàn)為性腺隨著人年齡增長(zhǎng)出現(xiàn)機(jī)能衰退并出現(xiàn)生長(zhǎng)激素缺乏等癥狀[8]。研究表明，MKRN3基因可能與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、分化和形態(tài)發(fā)生等重要生物信息調(diào)控功能有關(guān)[9]，主要通過抑制HPG軸下游的目標(biāo)發(fā)揮其生物學(xué)功能[10-11]。因此，推測(cè)MKRN3基因可能對(duì)綿羊的繁殖性狀也有一定影響。本研究選擇不同發(fā)情模式（季節(jié)性發(fā)情和常年發(fā)情）的綿羊品種，通過對(duì)綿羊MKRN3基因測(cè)序，探討其多態(tài)位點(diǎn)與產(chǎn)羔性狀的關(guān)聯(lián)性，尋找新的多態(tài)位點(diǎn)，為進(jìn)一步開展綿羊產(chǎn)羔機(jī)理的研究和分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 血樣采集及數(shù)據(jù)測(cè)定 21只蘇尼特羊血液樣本采自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗民羊牧業(yè)有限責(zé)任公司，22只灘羊血液樣本采自寧夏鹽池縣寧夏朔牧鹽池灘羊繁育有限公司，161只草原藏羊血液樣本采自西藏當(dāng)雄縣，101只湖羊血液樣本采自江蘇省徐州申寧羊業(yè)有限公司，52只策勒黑羊血液樣本采自新疆和田市策勒縣，380只小尾寒羊血液樣品采自山東省鄆城縣誠(chéng)聯(lián)小尾寒羊種羊場(chǎng)。所有羊只營(yíng)養(yǎng)以及管理水平保持一致，年齡相近，采用頸靜脈采血，檸檬酸葡萄糖抗凝，-20℃保存。同時(shí)記錄小尾寒羊產(chǎn)羔季節(jié)、胎次與產(chǎn)羔數(shù)。

1.2 DNA提取 使用血液DNA試劑盒（天根生化科技(北京)有限公司）提取綿羊血液樣本DNA，Nano Drop2000檢測(cè)DNA樣本濃度，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.3 基因分型 對(duì)MKRN3基因2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種中進(jìn)行基因分型，采用Sequenom MassARRAY?SNP技術(shù)進(jìn)行基因型檢測(cè)[12]。分型樣品為DNA，每個(gè)樣品需要量為20 μL，DNA濃度為 40～80 ng/μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2016軟件統(tǒng)計(jì)綿羊MKRN3基因2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（HE）和有效等位基因數(shù)（NE），并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。配合模型進(jìn)行最小二乘分析：

其中，yijkl為產(chǎn)羔數(shù)的記錄值，μ為群體平均值，LSi為第i個(gè)產(chǎn)羔季節(jié)的固定效應(yīng)（i=1，2，3，4），Pj為第j個(gè)胎次的固定效應(yīng)（j=1，2，3），Gk為MKRN3基因第k種基因型的固定效應(yīng)（k=1，2，3），eijkl為隨機(jī)殘差效應(yīng)（服從標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布）。

采用SPSS 19.0軟件程序中卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)完成常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種中基因頻率與基因型頻率差異顯著性檢驗(yàn)，并使用一般線性模型完成小尾寒羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MKRN3基因多態(tài)性分析 根據(jù)基因分型結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MKRN3基因g.275981C＞T位點(diǎn)存在CC、CT和TT共3種基因型；g.276999C＞T位點(diǎn)存在TT、TC和CC共3種基因型（圖1）。

圖1 MKRN3基因g.275981C＞T（上）、g.276999C＞T（下）位點(diǎn)分型結(jié)果

從表1可知，綿羊MKRN3基因g.275981C＞T位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種間差異不顯著（P＞0.05），g.276999C＞T位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種間差異極顯著（P＜0.01），且在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種中C均是優(yōu)勢(shì)等位基因。

從表2可知，綿羊MKRN3基因g.275981C＞T位點(diǎn)在6個(gè)綿羊品種中均表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25）；卡方適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，該位點(diǎn)在蘇尼特羊和策勒黑羊中均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05），在其余4個(gè)綿羊品種中則處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)。從表3可知，g.276999C＞T位點(diǎn)在6個(gè)綿羊品種中表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）；卡方適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，該位點(diǎn)在6個(gè)綿羊品種中均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.2 MKRN3基因2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系 從表4可知，g.275981C＞T位點(diǎn)與g.276999C＞T位點(diǎn)不同基因型與小尾寒羊不同胎次產(chǎn)羔數(shù)之間差異不顯著（P＞0.05），MKRN3基因2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)不同基因型與小尾寒羊不同胎次產(chǎn)羔數(shù)之間均無顯著關(guān)聯(lián)。

3 討 論

表1 MKRN3基因2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率

表2 MKRN3基因g.275981C＞T 多態(tài)位點(diǎn)在不同綿羊品種中的群體遺傳學(xué)分析

表3 MKRN3基因g.276999C＞T多態(tài)位點(diǎn)在不同綿羊品種中的群體遺傳學(xué)分析

表4 MKRN3基因2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)各基因型小尾寒羊的產(chǎn)羔數(shù)

綿羊MKRN3基因位于第15號(hào)染色體，屬于M蛋白家族[13]。M蛋白家族在物種間的廣泛保守性及在發(fā)育神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)，因此它在細(xì)胞中扮演著多個(gè)至關(guān)重要的角色[14]。大量研究表明，MKRN3基因與蛋白泛素化緊密相關(guān)，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及調(diào)控細(xì)胞周期、分化和形態(tài)發(fā)生的指示劑。MKRN3基因的mRNA表達(dá)模式對(duì)許多動(dòng)物青春期的啟動(dòng)具有抑制作用，MKRN3可能作為泛素連接酶在下丘腦水平抑制促性腺激素釋放激素（GnRH）的分泌，MKRN3基因變異可導(dǎo)致HPG軸的提前活化[15]。動(dòng)物繁殖與HPG軸的調(diào)控密切相關(guān)[16]，HPG軸頂端下丘腦釋放GnRH，GnRH以脈沖形式刺激垂體釋放黃體生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH），高脈沖GnRH 促進(jìn)LH 的分泌，反之則誘導(dǎo)FSH的合成，LH分泌升高引起卵泡成熟而排卵[17]。綜上所述，MKRN3基因在動(dòng)物繁殖中的作用十分重要。

本實(shí)驗(yàn)中，群體遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，MKRN3基因g.276999C＞T位點(diǎn)在6個(gè)綿羊品種中均表現(xiàn)為中度多態(tài)，表明其在6個(gè)綿羊品種中存在較大的選擇潛力。MKRN3基因g.275981C＞T位點(diǎn)在灘羊、湖羊、小尾寒羊和草原型藏羊中處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)，可能是因?yàn)樽匀贿x擇或人工選擇對(duì)該位點(diǎn)分布影響較大，也可能與本研究選擇的羊品種數(shù)量較少有關(guān)。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，MKRN3基因g.276999C＞T位點(diǎn)TC型各胎產(chǎn)羔數(shù)均高于CC型，推測(cè)該位點(diǎn)突變?cè)谝欢ǔ潭壬咸岣吡诵∥埠虻漠a(chǎn)羔能力。

突變能顯著改變動(dòng)物表型，1982年Davis等[18]在澳大利亞布魯拉綿羊中發(fā)現(xiàn)的FecB突變，就是BMPRIB基因的第746位發(fā)生A＞G突變導(dǎo)致的，最終顯著提高了布魯拉綿羊的排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)。目前普遍認(rèn)為MKRN3基因多態(tài)性與哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖有關(guān)。汪龍梅等[7]研究表明，豬MKRN3基因g.678T＞C位點(diǎn)與內(nèi)脂率及臀部膘厚顯著相關(guān)；Perry等[19]研究表明，人MKRN3基因多個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與青春期時(shí)間改變相關(guān)。目前MKRN3基因?qū)τ诰d羊繁殖功能的作用機(jī)制尚未明確，故開展綿羊MKRN3基因測(cè)序，尋找與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)的多態(tài)位點(diǎn)尤為重要。

本研究在綿羊MKRN3基因上發(fā)現(xiàn)的2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（ g.275981C＞T和 g.276999C＞T）均發(fā)生于第 1外顯子，g.275981C＞T沒有引起氨基酸改變，屬于同義突變，但單核苷酸的替換會(huì)改變mRNA的剪切效率或準(zhǔn)確性，從而影響蛋白質(zhì)表達(dá)水平[20]，同義突變還可以改變mRNA的構(gòu)象，降低mRNA的穩(wěn)定性，從而影響多肽鏈的三維折疊及修飾加工的過程，進(jìn)一步改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能，最終對(duì)動(dòng)物表型產(chǎn)生影響[21]。g.276999C＞T屬于錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第504位氨基酸由脯氨酸變?yōu)榻z氨酸，錯(cuò)義突變引起氨基酸替代，導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)或酶的生物學(xué)功能[22]。錯(cuò)義突變導(dǎo)致蛋白變化并決定動(dòng)物表型的變化。因此，MKRN3基因的2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)可能對(duì)于綿羊其他生物學(xué)功能有一定影響。

4 結(jié) 論

本研究篩選出綿羊MKRN3基因新的突變位點(diǎn)g.275981C＞T和g.276999C＞T，兩者與小尾寒羊各胎次產(chǎn)羔數(shù)之間均沒有顯著關(guān)聯(lián)，2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)均不適合用于小尾寒羊產(chǎn)羔性狀選育。