謝 蘇，李夢尋，孫義姍，孫曉梅，黃 濤

（石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000）

環(huán)狀 RNA（circular RNA，circRNA）是廣泛存在于各種生物體中的一種特殊的內(nèi)源性 RNA 分子，并具有調(diào)控基因表達的作用[1]。近年來，研究人員在人、鼠、線蟲、植物、古生菌生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在大量circRNA[2]。真核生物體中的circRNA大部分由外顯子構(gòu)成，具有良好的保守性以及組織特異性[3]。

circRNA具有高穩(wěn)定性、組織發(fā)育階段及細胞類型表達特異性等特征[4-5]，說明其具有成為生物標志物的潛能。與此同時，circRNA分子具有充當miRNA分子海綿、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、與 RNA 結(jié)合蛋白相互作用及翻譯蛋白質(zhì)等生物學功能[6]。目前關于circRNA在動物繁殖中的調(diào)控作用研究不多。Hansen等[7]研究發(fā)現(xiàn)，SrycircRNA可以間接參與小鼠的性別調(diào)控。同時，circRNA在哺乳動物大腦發(fā)育和組織發(fā)育的過程中可能發(fā)揮重要作用[8-9]；circRNA在胎兒大腦組織中的表達[10]也可能發(fā)揮重要作用。本實驗從RNA-seq結(jié)果中選擇梅山與杜洛克豬M2卵泡表達差異極顯著的circ0001651作為目標circRNA，旨在探究circRNA在豬卵泡發(fā)育過程中的表達情況，并通過生物信息學分析預測其可能的調(diào)控機制。 circRNA在豬卵泡發(fā)育上面尚未見報道，本文首次在高產(chǎn)豬和低產(chǎn)豬卵巢中對circRNA進行分析研究，為進一步探索circRNA調(diào)控母豬繁殖機理的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品采集 實驗選取二胎、發(fā)情正常、繁殖表現(xiàn)符合品種特征的梅山和杜洛克成年母豬各3頭，相同條件下飼喂，每天對其發(fā)情進行觀測。發(fā)情出現(xiàn)靜立反應時記做發(fā)情周期第0天，發(fā)情周期第14天注射獸用氯前列烯醇注射液，注射后第4天屠宰，取不同級別卵泡樣，按直徑分類（M1卵泡直徑：3.1～5.0 mm；M2卵泡直徑：5.1～7.0 mm）于液氮中凍存，同時取垂體、下丘腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、脂肪、卵巢、子宮、子宮角、輸卵管組織，用錫紙包裹，于液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器 主要試劑包括TRIzol試劑（Invitro-gen，Carlsbad，CA，USA）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primer-ScriptTMRT regagent Kit（TaKaRa）；LightCycler 480 SYBR Green、八連管（Roche）；RNA線性酶；DNA Maker、西班牙進口Agarose瓊脂糖等。

主要儀器有超低溫冰箱（-80℃）、恒溫水浴鍋、高壓滅菌鍋、移液槍、PCR儀、超凈工作臺、NanoDrop 2000、LightCycler 480實時熒光定量PCR儀、分析天平、高速離心機、電熱恒溫培養(yǎng)箱、水平電泳槽電泳儀；GelDoc X R型凝膠成像系統(tǒng)等。

1.3 總RNA提取與cDNA合成 取梅山和杜洛克成年母豬的兩級卵泡和不同組織100 mg于液氮中研磨，TRIzol法分別提取樣本總RNA，用2%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000驗證總RNA的完整性、濃度及純度，-80℃保存?zhèn)溆?；實時熒光定量PCR所用cDNA的合成分別按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作。

1.4 RNase R消化 對一部分總RNA進行RNase R消化處理，最后用RNA clean up商品試劑盒對 RNA 進行回收，具體步驟可參考試劑盒說明書，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設計與合成 在差異表達的circRNAs中挑選了circ0001651，設計特異性擴增反向剪切位點的引物（圖1）。引物設計好后交由新疆烏魯木齊市昆泰銳公司合成，引物序列見表1。

圖1 circRNA模式圖

表1 circ0001651及內(nèi)參引物序列

1.6 circ0001651組織表達譜分析 實驗以各組織與卵泡cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，對circ0001651進行實時熒光定量PCR檢測以分析其在不同組織中的表達情況。反應體系：SYBR?Green I PCR Mix 10 μL；上、下游引物（0.01nmol/μL）各 1μL；cDNA 模板 2 μL；加dd H2O至20 μL。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s。

1.7 circ0001651功能預測 本實驗使用targetscan7.0和miRanda軟件對circ0001651靶基因結(jié)合位點進行分析預測。并通過DAVID軟件和KOBAS軟件分別對circ0001651的宿主基因進行GO分析和KEGG分析。1.8 統(tǒng)計分析 以 2-△△Ct法[11]計算 circ0001651 在各組織及梅山豬和杜洛克豬各級卵泡中的相對表達量，用SPSS 19.0軟件中One-Way ANOVA方法分析，比較其在兩豬種內(nèi)不同級別卵泡及品種間同級別卵泡表達水平的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 circRNA鑒定 將RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，成功擴增出circ0001651的反向剪切位點（圖2）。同時進行了DNA測序驗證，測序結(jié)果進一步驗證了擴增結(jié)果的準確性（圖3）。

圖2 circRNA瓊脂糖凝膠電泳

圖3 circ0001651首尾鏈接序列測序峰圖

2.2 circRNA對RNase R的消化抗性 對circ0001651進行RNase R酶消化抗性實驗，通過熒光定量PCR方式進行檢驗。如圖4所示，circRNA由于具有特殊的閉合環(huán)狀的物理結(jié)構(gòu)，對RNase R消化具有一定的抗性，RNase R酶消化后仍然可檢測到circRNA。而線性的GAPDH內(nèi)參基因經(jīng)RNase R酶消化會發(fā)生降解，RNase R酶消化后無法檢測到其表達。

圖4 circRNA實時熒光定量分析

2.3 circ0001651在不同組織中的表達分析 如圖5所示，circ0001651在下丘腦、垂體、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、子宮、子宮角、輸卵管、脂肪、卵巢中均有不同程度的表達，說明circ0001651在豬的各個組織中廣泛表達。

圖5 circ0001651組織表達譜

2.4 circ0001651在卵泡中的表達分析 由圖6可知，circ0001651在梅山豬M2卵泡中的表達量顯著高于M1卵泡（P＜0.05），在杜洛克豬M1卵泡中的表達量極顯著高于M2卵泡（P＜0.01），提示該circRNA可能與卵泡發(fā)育有關。杜洛克豬M1卵泡中的表達量極顯著高于梅山豬M1卵泡（P＜0.01），梅山豬M2卵泡中的表達量極顯著高于杜洛克M2卵泡（P＜0.01），提示circ0001651在高低產(chǎn)豬種卵泡中的表達具有顯著差異性，可能具有促進卵泡發(fā)育的作用。

2.5 靶基因預測結(jié)果 通過targetscan7.0和miRanda軟件對circ0001651靶基因結(jié)合位點進行了分析預測。結(jié)果見表2。

圖6 circ0001651在梅山豬與杜洛克豬不同級別卵泡中的表達

表2 circ0001651靶基因預測

2.6 circ0001651的GO與KEGG分析 通過對circ0001651的靶基因進行GO和KEGG通路富集分析，預測其功能，結(jié)果如圖7所示。GO分析表明，circ0001651的宿主基因在細胞生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，包括Notch信號通路的負調(diào)控（GO:0045746）、凋亡過程（GO:0006915）、細胞形態(tài)發(fā)生調(diào)控（GO:0022604）、細胞周期調(diào)控（GO:0051726）、細胞生長調(diào)節(jié)（GO:0001558）、經(jīng)典Wnt信號通路的負調(diào)控（GO:0090090）。

KEGG通路分析顯示，該circRNA的宿主基因參與調(diào)控細胞生長發(fā)育相關信號通路，包括Hippo信號通路（ssc04390）、FoxO信號通路（ssc04068）、MAPK信號通路（ssc04010）、細胞周期信號通路（ssc04110）、p53信號通路（ssc04115）、JAK STAT信號通路（ssc04630）和PI3K-Akt信號通路（ssc04151）。

圖7 GO分析

2.7 circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡構(gòu)建 利用軟件Cytoscape3.6.0，根據(jù)RNA-seq結(jié)果構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)具有較多靶基因結(jié)合位點的sscmiR-1343以及ssc-miR-328可能協(xié)同circ0001651參與母豬的妊娠調(diào)控過程，見圖8。

圖8 circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡圖

3 討 論

circRNA成為目前RNA領域研究的最新熱點，目前circRNA的研究多數(shù)停留在芯片檢測和高通量測序?qū)用嫔?，對其機理的探究僅局限于人類的疾病、免疫及模式生物上，而在豬等重要的經(jīng)濟動物生長發(fā)育及繁殖上circRNA的研究相對滯后，仍然處于摸索階段。

Ye等[12]在水稻和擬南芥中分別鑒定出約12 000個和6 000個circRNA。Guo等[13]通過RNA測序檢測出7 112種人類circRNA及635種小鼠circRNA。Fan等[14]研究表明，circRNA可能在哺乳動物的早期胚胎發(fā)育中扮演重要角色。Gao等[15]發(fā)現(xiàn)細胞共有的circRNA通常具有較高的表達水平，說明這些circRNA可能具有重要的生理功能。

有研究表明，circRNA大部分都是由外顯子序列構(gòu)成的，在不同物種中具有保守性及組織時空表達特異性[16]。Memczak等[17]、Kino等[18]研究結(jié)果顯示，超過100 種circRNA的表達量顯著高于對應的mRNA，說明其可能適合作為臨床血液樣本中的生物標志物。與此同時，circRNA可以通過調(diào)控與癌癥相關miRNAs或信號通路以控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[19]。本實驗所選的circRNA是通過高通量測序技術結(jié)合計算機軟件分析獲得，高通量測序結(jié)果顯示circ0001651在梅山和杜洛克豬中等卵泡中差異極顯著。本研究利用Real-time PCR法檢測circ0001651在2組標本間的相對表達量發(fā)現(xiàn)，Real-time PCR法和高通量測序法測得的基因表達的差異具有相同趨勢，間接證實了高通量測序的可靠性。

本研究發(fā)現(xiàn)，circ0001651在杜洛克豬各組織中廣泛表達且范圍波動較大，其中在卵巢中的較高表達提示circ0001651可能參與母豬生殖活動過程；circ0001651在梅山豬M2卵泡中的表達量極顯著高于杜洛克豬M2卵泡，與高通量測序結(jié)果表達趨勢一致。此外，本研究通過構(gòu)建circRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡預測得到其潛在靶基因FRMD1、DUSP5、IL20RB可能通過Hippo信號通路、MAPK信號通路（ssc04010）以及JAK STAT信號通路之間的關聯(lián)作用影響細胞的增殖、分化及凋亡等；靶基因GADD45G與細胞周期及卵巢發(fā)育相關通路如FoxO信號通路以及p53信號通路等關聯(lián)，可能參與了卵泡發(fā)育及排卵過程；LAMB3參與了PI3KAkt信號通路，而PI3K-Akt通路對于調(diào)控哺乳動物卵巢發(fā)育及卵泡發(fā)生發(fā)展過程有著重要意義[20-21]。因此，circ0001651調(diào)控卵泡發(fā)育可能是通過其靶基因間接實現(xiàn)的，其與預測所得靶基因之間具體的靶向關系仍需進一步證明。

4 結(jié) 論

組織表達譜結(jié)果顯示，circ0001651在豬下丘腦、垂體、輸卵管、卵巢中表達水平相對較高。circ0001651在梅山豬M2卵泡中的表達量極顯著高于杜洛克豬M2卵泡。通過KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，circ0001651參與細胞周期、凋亡及卵巢生長發(fā)育相關通路。circRNA功能預測結(jié)果表明，circ0001651可能通過對其靶基因的調(diào)控作用間接參與卵泡發(fā)育過程。