劉露 劉麗娟 李印 黃曉新 康巍 韋波 蘇丹柯 金觀橋

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像中心

2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，鼻咽癌新發(fā)病例129 079例，死亡病例72 987例［1］。鼻咽癌局部控制率已明顯提高，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是鼻咽癌治療失敗的主要原因。初診鼻咽癌患者中有4%～10%已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療后仍有15%～30%發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［2］，因此研究鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)分子標(biāo)志物對預(yù)后評估和制定治療方案具有重要意義［3］。內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的E-選擇素（ELAM-1）與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的配體sLex或sLea特異性結(jié)合，可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)的黏附和識別，促進(jìn)轉(zhuǎn)移發(fā)生。WENZEL等［4］研究認(rèn)為ELAM-1是促進(jìn)頭頸鱗癌轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物之一，它在腫瘤細(xì)胞的黏附、運動、穿出等環(huán)節(jié)中起重要作用，但未通過體內(nèi)實驗進(jìn)一步驗證。本研究旨在建立穩(wěn)定性好且與人鼻咽癌生物學(xué)特性相似的裸鼠移植瘤轉(zhuǎn)移模型，并檢測荷瘤裸鼠移植瘤組織中ELAM-1的表達(dá)，探討其與鼻咽癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為闡明鼻咽癌轉(zhuǎn)移機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與細(xì)胞株

16只BALB/c雌性裸鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心（許可證號：SCXK桂2014-0002），體重13～15 g，鼠齡5周，隨機(jī)分配到4籠，每籠4只，飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心SPF級實驗室，飼養(yǎng)條件為溫度20～27℃，濕度45%～65%，給予滅菌水和飼料。鼻咽癌SUNE-1亞株5-8F（高成瘤、高轉(zhuǎn)移細(xì)胞）購自美國ATCC公司，采用蘇州凈化設(shè)備儀器廠超凈工作臺和美國Thermo公司細(xì)胞培養(yǎng)箱，在37℃、5%CO2飽和度條件下培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠人鼻咽癌移植瘤模型構(gòu)建 用規(guī)格為1 mL的注射器抽取0.02 mL細(xì)胞懸液（生理鹽水重懸對數(shù)生長期的5-8F細(xì)胞，濃度為1×108個/mL），約含2×106個細(xì)胞，注射于已經(jīng)酒精消毒的裸鼠左后肢爪墊，緩慢退針。每隔2 d觀察裸鼠生長狀態(tài)和成瘤情況，測量裸鼠體重及移植瘤長短徑，并根據(jù)公式V=a×b2×1/2（V為體積，a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑）計算裸鼠移植瘤體積。在第8周以頸椎脫臼方式處死裸鼠。

1.2.2 HE染色檢測鼻咽癌裸鼠移植瘤模型的轉(zhuǎn)移情況 移植瘤、淋巴結(jié)組織和其他轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、4 μm厚切片，二甲苯和梯度無水乙醇脫水，用Harris蘇木精水溶液將石蠟切片染色4～8 min，將石蠟切片放入酒精伊紅染色液中2～3 min，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。移植瘤、淋巴結(jié)組織和其他轉(zhuǎn)移組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞時即確定為轉(zhuǎn)移灶，根據(jù)是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤，將裸鼠分為轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組。

1.2.3 免疫組化SP法檢測ELAM-1的表達(dá)水平 4 μm厚切片常規(guī)脫蠟至水，預(yù)熱EDTA修復(fù)液（pH8.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加1滴或50 μL過氧化酶阻斷溶液，室溫下孵育10 min，滴加稀釋好的一抗（ELAM-1鼠抗人單克隆抗體，稀釋濃度為1∶100；美國默克密理博公司），37℃濕盒中孵育1 h，滴加二抗（即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTM SP檢測試劑盒，福州邁新公司），室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染30 s后脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察染色情況。

免疫組化定量分析：在移植瘤切片中選取染色均勻、背景干凈且無壞死的區(qū)域，用EVOS FL Auto全自動細(xì)胞成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集（×400倍，曝光條件保持一致），用Image J軟件（V1.51）將圖像中的陽性區(qū)域轉(zhuǎn)為灰度圖像［5］，并計算出平均光密度值（OD），OD值越大表示ELAM-1表達(dá)水平越高。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用獨立樣本t檢驗比較轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組中ELAM-1的表達(dá)水平、裸鼠原始體重及4～7周后裸鼠瘤體體積的差異。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌裸鼠移植瘤模型腫瘤生長及轉(zhuǎn)移情況

裸鼠造模后1周均成瘤，成瘤率為100.0%。約30 d，裸鼠左側(cè)腹股溝可觸及腫大淋巴結(jié)，見圖1。HE染色結(jié)果顯示，10只裸鼠發(fā)生轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移組），轉(zhuǎn)移率為62.5%，其中7只僅淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，1只僅腹盆腔轉(zhuǎn)移，2只既發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移又出現(xiàn)腹盆腔轉(zhuǎn)移；6只裸鼠未發(fā)生轉(zhuǎn)移（非轉(zhuǎn)移組）。兩組裸鼠原始體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義［（13.83±0.56）gvs（14.62±0.30）g，t=1.026，P=0.071）］。繪制裸鼠移植瘤生長曲線，16只裸鼠潛伏期為7～14 d，造模后4～7周，瘤體體積呈指數(shù)形式增長，且轉(zhuǎn)移組移植瘤增長速度較非轉(zhuǎn)移組快，非轉(zhuǎn)移組裸鼠瘤體體積小于轉(zhuǎn)移組［（198.91±163.29）mm3vs（268.76±174.31）mm3，t=4.376，P=0.005］，見圖 2。

圖1 鼻咽癌裸鼠移植瘤模型淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況Fig.1 Lymph node metastasis in nude mice

圖2 裸鼠鼻咽癌移植瘤生長曲線Fig.2 Growth curves of transplanted tumor of nasopharyngeal carcinoma in nude mice

2.2 鼻咽癌裸鼠移植瘤及轉(zhuǎn)移組織的HE染色結(jié)果

顯微鏡下觀察可見移植瘤組織及腹盆腔轉(zhuǎn)移組織的癌細(xì)胞呈卵圓形或圓形，核大、深染為深藍(lán)色、核分裂像增多、核質(zhì)比增大，細(xì)胞異形性顯著，胞漿及纖維組織呈深淺不等的紅色。組織結(jié)構(gòu)異形性明顯。

轉(zhuǎn)移組淋巴結(jié)的HE染色顯示，正常淋巴組織中可見散在大小不等的癌巢，癌細(xì)胞細(xì)胞核為深藍(lán)色且異形性明顯，胞漿及纖維組織為深淺不一的紅色；部分癌巢內(nèi)可見大片壞死，與人鼻咽癌細(xì)胞形態(tài)一致，見圖3。

圖3 鼻咽癌裸鼠移植瘤及轉(zhuǎn)移組織的淋巴結(jié)HE染色結(jié)果（HE×400）Fig.3 HE staining results of lymph node xenografts and metastatic tissues of nasopharyngeal carcinoma in nude mice（HE×400）

2.3 鼻咽癌裸鼠移植瘤中ELAM-1的表達(dá)情況

所有鼻咽癌裸鼠移植瘤、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤中的ELAM-1表達(dá)均為陽性，主要表達(dá)于細(xì)胞膜。轉(zhuǎn)移組移植瘤OD值大于非轉(zhuǎn)移組（0.4497±0.0705vs0.0435±0.0082，t=4.388，P=0.001），表明轉(zhuǎn)移組移植瘤ELAM-1的表達(dá)水平高于非轉(zhuǎn)移組，見圖4。

圖4 鼻咽癌裸鼠移植瘤中ELAM-1的表達(dá)水平Fig.4 Expression level of ELAM-1 of nasopharyngeal carcinoma in nude mice

3 討論

鼻咽癌主要采用以放療為主的綜合治療，局部復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是其治療失敗的主要原因。鼻咽癌的轉(zhuǎn)移是一個非常復(fù)雜的過程，涉及多種基因及多條信號傳導(dǎo)通路，包含了多種生物學(xué)行為，但具體機(jī)制尚未完全闡明。建立動物腫瘤模型是進(jìn)行腫瘤病因?qū)W、預(yù)防和治療研究中不可或缺的手段，良好的動物模型是進(jìn)行后續(xù)實驗的關(guān)鍵步驟，應(yīng)具備穩(wěn)定性高，易操作、易重復(fù)，且移植瘤的形態(tài)及生物學(xué)特性與人體腫瘤相似。包偉晶等［6］綜述了多種鼻咽癌裸鼠模型建立的方法，其中采用CNE-2Z建立的皮下移植瘤模型成瘤率高，但其轉(zhuǎn)移率低；采用5-8F細(xì)胞系建立的尾靜脈移植瘤轉(zhuǎn)移模型雖經(jīng)血道可轉(zhuǎn)移至肺、肝，但不發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且無法確定原發(fā)瘤位置。目前尚未見5-8F細(xì)胞系爪墊移植瘤轉(zhuǎn)移模型。本研究將高成瘤、高轉(zhuǎn)移的5-8F細(xì)胞接種于裸鼠爪墊構(gòu)建裸鼠鼻咽癌轉(zhuǎn)移模型，發(fā)現(xiàn)造模后1周左右16只裸鼠爪墊均成瘤，成瘤率為100.0%。約30 d后裸鼠腹股溝可觸及腫大淋巴結(jié)，通過病理證實16只裸鼠中10只出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，其中7只僅淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，1只僅腹盆腔轉(zhuǎn)移，2只既發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移又出現(xiàn)腹盆腔轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為62.5%，HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與人鼻咽癌細(xì)胞一致，說明本研究成功構(gòu)建了高轉(zhuǎn)移、穩(wěn)定性好的裸鼠鼻咽癌轉(zhuǎn)移模型。進(jìn)一步繪制裸鼠移植瘤生長曲線，發(fā)現(xiàn)16只裸鼠潛伏期為7～14 d，原因可能是接種早期大部分癌細(xì)胞處于壞死吸收，造模后4～7周，隨著新生腫瘤血管的出現(xiàn)，殘存的癌細(xì)胞開始增殖并形成腫塊，腫瘤體積增長呈指數(shù)形式，后期隨代謝產(chǎn)物堆積、營養(yǎng)不足出現(xiàn)壞死及有絲分裂周期延長而逐漸減慢，最后進(jìn)入平臺期，其生長規(guī)律符合Gompertz函數(shù)［7］，再次印證本研究建立的鼻咽癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型具有良好的穩(wěn)定性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移組移植瘤增長速度較非轉(zhuǎn)移組快，且兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，但具體原因不明。

ELAM-1是細(xì)胞黏附分子家族中的一員，具有玉型跨膜蛋白特征，由589個氨基酸構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)組成包括凝集素區(qū)、表皮生長因子區(qū)、4～9個短重復(fù)序列、單一的跨膜區(qū)和1個胞漿。ELAM-1所結(jié)合的配體sLex或sLea為糖蛋白或糖脂結(jié)構(gòu)，它們互為同分異構(gòu)體，大量存在于多種癌組織中。已有研究報道ELAM-1的表達(dá)程度與肺癌、結(jié)直腸癌、食管癌、胰腺癌等腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［8-13］。本團(tuán)隊張濤等［14］前期研究發(fā)現(xiàn)ELAM-1在46例人鼻咽癌組織中高表達(dá)，且轉(zhuǎn)移組表達(dá)陽性率明顯高于非轉(zhuǎn)移組，提示ELAM-1可能促進(jìn)鼻咽癌轉(zhuǎn)移。鄧玫等［15］亦得到類似結(jié)論。本研究成功建立鼻咽癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型后，進(jìn)一步采用免疫組化法檢測ELAM-1的表達(dá)，結(jié)果顯示所有鼻咽癌裸鼠移植瘤、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤中ELAM-1表達(dá)均呈陽性，且轉(zhuǎn)移組ELAM-1表達(dá)量明顯高于非轉(zhuǎn)移組，提示ELAM-1在鼻咽癌轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，其在鼻咽癌細(xì)胞表面的分布，可能使腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。通常情況下，ELAM-1合成后以分泌顆粒的形式儲存于內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，在白細(xì)胞介素1、α腫瘤壞死因子和細(xì)菌脂多糖等因子刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞定向活化并釋放ELAM-1，以共價鍵的形式與腫瘤細(xì)胞表面配體sLex或sLea在凝集素樣區(qū)相互結(jié)合，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的滾動、黏附，而該過程是誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵［16］。但本研究16只裸鼠解剖時間未設(shè)置明顯梯度，未能進(jìn)一步研究ELAM-1與腫瘤生長時間的關(guān)系，在后續(xù)實驗中將擴(kuò)大樣本量并設(shè)置明顯的時間梯度進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過爪墊注射成功構(gòu)建了穩(wěn)定性好、轉(zhuǎn)移率高的鼻咽癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型，且ELAM-1在裸鼠鼻咽原發(fā)癌、轉(zhuǎn)移癌中高表達(dá)，可能是鼻咽癌轉(zhuǎn)移的重要分子標(biāo)志物，為鼻咽癌及轉(zhuǎn)移灶的監(jiān)測、臨床治療以及患者預(yù)后評估等提供新的思路。