樊 濤, 郭彥偉, 任金山, 蘇書娟

(1南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院放療科， 河南 南陽 473000； 2鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤科， 河南 鄭州 470000)

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，死亡率高，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高。導(dǎo)致其高死亡率的主要原因是卵巢癌的起病隱匿，大多數(shù)患者確診時(shí)已到達(dá)晚期，并出現(xiàn)了遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，因此進(jìn)行手術(shù)治療難以去除癌灶，只能采取放化療的規(guī)范性治療[1-2]。但放化療容易出現(xiàn)耐藥性，且統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明接受規(guī)范性治療的患者仍有約60%的復(fù)發(fā)率。因此如何克服放化療的耐藥性是目前卵巢癌治療研究中的重點(diǎn)問題。

紫草素(shikonin,Shk)是中藥紫草科紫草屬紫草的主要有效成分。已有研究表明紫草素具有抗炎、抗病毒、抗氧化、促進(jìn)傷口愈合以及調(diào)節(jié)免疫功能等多種功效[3-4]。近年來，紫草素的抗腫瘤作用逐漸受到學(xué)者們的關(guān)注，已有報(bào)道指出紫草素對(duì)乳腺癌、宮頸癌和白血病等具有一定的抑制作用[5-7]。研究表明，紫草素可能通過上調(diào)Bax表達(dá)以及下調(diào)Bcl-2表達(dá)來抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的體外增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[8]。但鮮有紫草素對(duì)卵巢癌細(xì)胞放射敏感性的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3，采取紫草素與X射線聯(lián)合干預(yù)，探討紫草素對(duì)SKOV-3細(xì)胞的放射增敏作用并討論可能的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。胰蛋白酶和RPMI-1640培養(yǎng)液購自HyClone；胎牛血清購自Gibco；MTT試劑、抗β-actin抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Shk購自中國藥品生物制品鑒定所；青霉素和鏈霉素購自華北制藥股份有限公司；碘化丙啶(propidium iodide,PI)購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；小鼠抗人p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT抗體購自Santa Cruz；其它試劑購自國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 向SKOV-3細(xì)胞株加入適量含10%胎牛血清、青霉素與鏈霉素各1×105U/L的RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，并調(diào)整細(xì)胞密度為2×109/L。

2.2SKOV-3細(xì)胞活力的檢測(cè) 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/L，接種于96孔培養(yǎng)板中，加入紫草素使最終濃度為0、5、10、20、40、80和120 mg/L(其中以0 mg/L為空白對(duì)照組)，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱48 h，加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入二甲基亞砜150 μL，于570 nm處檢測(cè)吸光度(A)，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。細(xì)胞相對(duì)活力(%)=(藥物組A值-空白對(duì)照組A值)/(對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)×100%，每個(gè)濃度設(shè)3復(fù)孔，繪制存活曲線。

2.3克隆形成實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為2組，放射組：僅給予不同劑量(0、2、4、6和8 Gy)X射線照射處理；聯(lián)合組：給予8 mg/L紫草素和不同劑量(0、2、4、6和8 Gy)X射線照射處理。照射方法：將培養(yǎng)板放置于照射野(20 cm×20 cm)內(nèi)，直線加速器6 MV-X線照射，源皮距(SSD)為80 cm，劑量率為300 cGy/min。聯(lián)合組在照射前采用紫草素培養(yǎng)48 h，更換含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)7 d。PBS液洗滌2次，甲醛固定，吉姆薩液染色，晾干，計(jì)數(shù)。多靶單擊型模型公式SF=1-(1-e-D/D0)N擬合細(xì)胞存活曲線，其中SF為細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，D為放射劑量(Gy)，D0代表平均致死劑量，N為外推數(shù)，lnN=Dq/D0，Dq代表準(zhǔn)閾劑量。并計(jì)算放射增敏比(sensitization enhancement ratio,SER)，SER=D0放射組/D0聯(lián)合組。

2.4SKOV-3細(xì)胞周期的檢測(cè) 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為2×107/L，實(shí)驗(yàn)分4組：空白對(duì)照組(control組)、單藥組(Shk組，8 mg/L Shk)、照射組(8 Gy組，8 Gy X射線照射處理)和聯(lián)合組(Shk+8 Gy組，給予8 mg/L紫草素培養(yǎng)48 h后再進(jìn)行 8 Gy X射線照射處理)。分別將加藥與照射完畢的細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并調(diào)整濃度為1×109/L。800×g離心10 min，PBS洗滌2次，重懸細(xì)胞，加入4 μL碘化丙啶，采用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期的變化。

2.5Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 收集SKOV-3細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST液洗膜2次，將PVDF膜轉(zhuǎn)移至裝有封閉液的器皿中室溫下封閉2 h，TBST液洗膜3次，加入I抗(抗PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT和β-actin抗體，均按照1 ∶2 000稀釋)，4 ℃條件下孵育過夜，TBST液洗膜3次，加入相對(duì)應(yīng)的II抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(1 ∶2 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST液洗滌3次，化學(xué)發(fā)光法顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法檢測(cè)SKOV-3細(xì)胞活力

在0～80 mg/L濃度范圍內(nèi)SKOV-3細(xì)胞活力隨紫草素濃度增大而降低，而80 mg/L與120 mg/L紫草素時(shí)SKOV-3細(xì)胞活力無差異，IC50為(38.54±0.57) mg/L，見圖1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用20%×IC50作為實(shí)驗(yàn)研究濃度，即8 mg/L。

2 紫草素對(duì)SKOV-3細(xì)胞放射增敏作用

與放射組相比，經(jīng)過紫草素與X射線聯(lián)合處理后的SKOV-3細(xì)胞的存活曲線左移，放射生物學(xué)參數(shù)Dq、Do和N的值均降低，見表1、圖2。SER為1.45±0.05。

Figure 1.Effect of shikonin on the viability of SKOV-3 cells. Mean±SD.n=6.

圖1紫草素對(duì)SKOV-3細(xì)胞活力的影響

表1 紫草素對(duì)SKOV-3細(xì)胞放射生物學(xué)參數(shù)的影響

*P<0.05vsradiotherapy group.

Figure 2.Effect of shikonin on the survival curve of SKOV-3 cells. A: clone formation experiment； B: cell survival curve fitting using multi-target single-hit model. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsradiotherapy group.

圖2紫草素對(duì)SKOV-3細(xì)胞存活曲線的影響

3 紫草素對(duì)SKOV-3細(xì)胞周期分布的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與control組相比，Shk組的SKOV-3細(xì)胞G2/M期比例無顯著差異；8 Gy組的SKOV-3細(xì)胞G2/M期所占比例顯著高于control組(P<0.05)；Shk+8 Gy組的SKOV-3細(xì)胞G2/M期所占比例顯著低于8 Gy組，卻顯著高于control組與Shk組(P<0.05)，見圖3。

4 PI3K與Akt蛋白表達(dá)及其磷酸化水平

以β-actin為內(nèi)參照，與control組相比，Shk組的p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平略下降，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，經(jīng)過射線照射后，p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Shk聯(lián)合射線照射后，顯著降低p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，見圖4。

討 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在0～80 mg/L濃度范圍內(nèi)隨紫草素濃度增大，對(duì)SKOV-3細(xì)胞存活率的抑制作用逐漸增強(qiáng)，提示紫草素對(duì)卵巢癌細(xì)胞株細(xì)胞SKOV-3的增殖具有抑制作用。當(dāng)紫草素濃度到達(dá)約80 mg/L時(shí)，SKOV-3細(xì)胞隨紫草素濃度增加不再發(fā)生明顯改變，IC50為(38.54±0.57) mg/L。研究表明，理想的放射增敏劑本身對(duì)腫瘤組織作用不強(qiáng)且較小劑量即有放射增敏的作用[9]，因此常選用IC50的20%，即接近無毒濃度進(jìn)行放射增敏研究，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用紫草素的濃度為8 mg/L。多靶單擊模型繪制SKOV-3細(xì)胞的存活曲線顯示，不同照射劑量聯(lián)合組的細(xì)胞存活率均低于放射組，提示紫草素具有增強(qiáng)X射線對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的殺傷作用；與放射組相比，聯(lián)合組的存活曲線往左下方偏移，Dq值減小，肩區(qū)減少，提示紫草素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的亞致死性損傷修復(fù)能力減弱，D0值減少，提示紫草素具有增加卵巢癌細(xì)胞X射線敏感性的作用。

Figure 3.Effect of shikonin on cell cycle of SKOV-3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs8 Gy group.

圖3紫草素對(duì)SKOV-3細(xì)胞周期分布的影響

細(xì)胞的放射敏感性隨周期時(shí)相變化而有所不同，G2/M期的細(xì)胞對(duì)射線最為敏感，并在M期達(dá)到峰值，S期細(xì)胞對(duì)射線的敏感性最差，因此細(xì)胞處于G2/M期腫瘤細(xì)胞受到射線放射引起DNA損傷后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期被阻滯于G1/S期或G2/M期，進(jìn)行DNA損傷的修復(fù)[10]，未能成功修復(fù)則啟動(dòng)凋亡信號(hào)使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡[11]。研究顯示，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，細(xì)胞的放射敏感性最高[11]。一般腫瘤細(xì)胞失去G1/S期檢測(cè)點(diǎn)的調(diào)控，放射誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA損傷后顯示G2/M期阻滯[12]。而細(xì)胞G2/M期阻滯越明顯，越有利于細(xì)胞輻射后損傷的修復(fù)，對(duì)于腫瘤的放射治療不利?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫草素在一定程度上可以緩解X射線照射引起的SKOV-3細(xì)胞G2/M期阻滯，從而增加SKOV-3細(xì)胞的放射敏感性。推測(cè)紫草素通過降低SKOV-3細(xì)胞G2/M期阻滯，影響細(xì)胞有絲分裂周期及轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

Figure 4.Effect of shikonin on the protein levels of p-PI3K and p-AKT. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs8 Gy group.

圖4紫草素對(duì)p-PI3K與p-AKT蛋白表達(dá)的影響

PI3K/AKT信號(hào)通路受多種因素，多個(gè)步驟調(diào)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)，AKT的Ser473位點(diǎn)磷酸化后，可激活其下游各種因子，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞各種生物學(xué)活動(dòng)[13]。近年觀察在放射低敏感性腫瘤細(xì)胞中，PI3K/AKT信號(hào)通路存在過度激活的現(xiàn)象[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示紫草素能夠降低SKOV-3細(xì)胞中PI3K和AKT的磷酸化水平，推測(cè)可能是通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，從而提高SKOV-3細(xì)胞的放射敏感性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過體外細(xì)胞學(xué)的研究，證實(shí)了紫草素對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3具有提高放射敏感性的作用，其主要機(jī)制可能涉及到抑制PI3K/AKT信號(hào)通路和改變細(xì)胞周期分布。