張陽敏， 羅筱衍， 徐燕霞， 周東明， 張立瑩， 傅晉翔

(蘇州大學附二院血液科， 江蘇 蘇州215004)

間隙連接(gap junction，GJ)是普遍存在的包含細胞內(nèi)通道的特殊胞膜區(qū)域，是細胞間連接方式的一種，由間隙連接蛋白(connexin，Cx)所構(gòu)成[1]。相鄰細胞間通過間隙連接所介導的細胞間隙連接(gap junction intercellular communication，GJIC)進行信息和能量物質(zhì)交換，參與細胞間物質(zhì)交換的代謝偶聯(lián)和電信號傳遞的電偶聯(lián)，對細胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化等生理過程起著重要的調(diào)控作用[2]。完整GJ是由相鄰胞膜上2個半通道相互作用而形成的細胞間空間，由不同Cx組成的GJ具有不同的通透特性，目前已證實人類細胞共表達21種Cx，而骨髓中僅表達3種Cx分子，即Cx31、Cx43和Cx45。造血細胞則以表達Cx43為主[3]，小鼠敲除Cx43基因后，通常因心臟發(fā)育異常在出生后數(shù)小時內(nèi)死亡而不利于進一步研究[4-5]。本研究使用Cx43 loxP/loxP和Lyz-Cre/+轉(zhuǎn)基因小鼠進行雜交，篩選出僅在造血系統(tǒng)條件性敲除Cx43基因(Cx43-/-)的小鼠作為動物模型，并對骨髓和髓外造血器官及外周血進行鑒定，進一步研究Cx43在維持造血細胞自我更新及功能穩(wěn)定中的作用，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗動物的飼養(yǎng)及繁殖

Cx43 loxP/loxP 小鼠購自美國Jackson實驗室；Lyz-Cre/+小鼠購自江蘇省實驗動物中心。引種后置蘇州大學醫(yī)學院無特定病原體級動物房中進行飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度18～24 ℃，濕度40%～60%。小鼠籠盒每周進行1次消毒處理，墊料、飼料均經(jīng)過[60Co-γ]照射滅菌處理，飲水經(jīng)過高溫高壓滅菌處理。繁殖采用雌雄比例2 ∶1同籠的方式進行，每籠3只小鼠，每胎平均約產(chǎn)6～8只幼鼠，幼鼠出生23～30 d(體重10～12 g)后進行斷奶、分籠。

2 實驗方法

2.1小鼠的基因型鑒定 小鼠基因型的鑒定參考報道[6]的方法選用小鼠尾部組織，出生7 d編號后剪取尾尖 1 cm，置無菌試管中，液氮保存，備用。按北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的組織基因組DNA提取試劑盒說明書抽提DNA，并測量吸光度(A)值，后采用常規(guī)PCR法分析其基因型。檢測的引物如下, loxP的上游引物序列為5’-CTTTGACTCTGATTACAGAGCTTAA-3’，下游引物序列為5’-GTCTCACTGTTACTTAACAGCTTGA-3’；Cre的上游引物序列為5’-CCCAGAAATGCCAGATTACG-3’，下游引物序列為5’-CTTGGGCT -GCCAGAATTTCTC-3’。loxP純合僅有580 bp條帶，loxP雜合則有580 bp和490 bp 2條條帶，野生型(Cx43+/+，即不含loxP位點)僅有490 bp條帶，即loxP/loxP=580 bp，wt/wt=490 bp，wt/loxP=490 bp+580 bp；基因組有Cre插入則出現(xiàn)700 bp的條帶，否則沒有條帶。

2.2小鼠不同組織中Cx43基因表達變化的檢測 分別收集Cx43-/-小鼠(KO組)和雜合子小鼠(loxP組)外周血、骨髓、肝臟、脾臟、腎臟和心臟等組織，按RNeasy Mini Kit 試劑盒(Qiagen)操作步驟抽取總MRNA。按SensiScript RT Kit 試劑盒(Qiagen)操作步驟逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈。取1 μL 逆轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物，用β-actin引物進行PCR擴增，取擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈(GelDoc1000，Bio-Rad)下觀測，確定cDNA是否逆轉(zhuǎn)錄成功。Cx43的上游引物序列為5’-CCCACCTTTGTGTCTTCCAT-3’，下游引物序列為5’-TTGCCTCCCTGATGCTAACT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’，下游引物序列為5’-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’。qPCR檢測不同組織Cx43的表達。qPCR總反應(yīng)體系(20 μL)：SYBR(GenePharma)10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，無核酸酶水7.2 μL。每個樣本重復做3次，反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min ；95 ℃ 12 s、62 ℃40 s， 45個循環(huán)；以GAPDH作為內(nèi)參照，由公式2-ΔΔCt計算Cx43 mRNA在KO組和loxP組小鼠中的相對表達量。

2.3小鼠骨髓造血細胞分離及鑒定 6～8周齡Cx43-/-及Cx43+/+小鼠各8只，體重18～20 g，經(jīng)眼球取血，處死后置于75%乙醇中消毒,無菌條件下分離雙側(cè)股骨。股骨經(jīng)反復沖洗后，所得細胞懸液通過4號針尖，使其成為單個細胞懸液。所得骨髓細胞用PBS液洗滌2次。所得細胞經(jīng)計數(shù)及臺盼藍染色檢測細胞存活率后備用。

2.45-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)處理及骨髓細胞分析 6～8 周齡Cx43-/-及Cx43+/+小鼠各10只，體重18～20 g，取2種小鼠各5只按125 mg/kg分別從尾靜脈注入溶于生理鹽水的5-FU，另5只為對照組，僅予同等量的生理鹽水。在化療前及化療后第5和10及15 天經(jīng)眼球后取血100 μL，測定其白細胞、血小板及血紅蛋白。

2.5骨髓移植實驗Cx43-/-及Cx43+/+小鼠各10只，體重18～20 g，分別給予7.5 Gy(60Co-γ)的致死量照射，劑量率1 Gy/min，照射后6 h分別予事先準備就序的骨髓細胞，按每只3×106的數(shù)量尾靜脈注入。2周后處死小鼠檢測造血及免疫細胞的重建情況。收集血液，并分離股骨和脛骨，除少量固定后切片外，收集其骨髓細胞，所有細胞經(jīng)NH4Cl處理溶解紅細胞，并與抗Fcg II和III受體(CD16/32，clone 2.4G2，Pharmingen)共同孵育15 min后，經(jīng)無鈣、鎂PBS洗滌后，與PE、FITC或APC標記的單抗孵育30 min后，流式細胞術(shù)檢測。選用單抗如下：CD45R(clone RA3-6B2)、 Gr-1(clone RB6-8C5)、CD4(clone GK1.5)、CD8a(clone 53-6.7)、TCRαβ(clone H57-597)、 Mac-1(clone M1/70)、抗sIgM、TER119(Ly-76)、 Sca-1(clone D7)及CD117(clone 2B8)，單抗及對照均購自Pharmingen。

2.6體外造血細胞集落形成實驗 分離上述移植小鼠骨髓細胞，采用甲基纖維素半固體培養(yǎng)，簡述如下：將預(yù)制的2%甲基纖維素、2倍濃度RPMI-1640培養(yǎng)基、30%胎牛血清及2×109/L小鼠骨髓細胞充分混均，使其成終濃度為1%甲基纖維素、15%胎牛血清及2×108/L細胞的混合物，加入細胞因子如下：CFU-GM所用細胞因子為GM-CSF(20 μg/L)、SCF(100 μg/L)、IL-3(20 μg/L)；CFU-E 所用細胞因子為EPO、IL-3(20 μg/L) 。接種于6 孔板, 每孔2 mL，置含5 % CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)第14 天 計數(shù)集落數(shù)，細胞數(shù)≥50為集落。

3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，行Mann-WhitneyU檢驗和Student’st檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 Cx43基因敲除小鼠的繁殖及鑒定

親代Cx43 loxP/loxP小鼠與Lyz-Cre/+小鼠交配產(chǎn)生的F1代小鼠經(jīng)PCR共檢出2種基因型，即Cx43 loxP/-_Lyz-Cre/+和Cx43 loxP/-，各占約50%。Cx43 loxP/-_Lyz-Cre/+小鼠與Cx43 loxP/loxP小鼠雜交，其子代經(jīng)PCR鑒定共有4種基因型，即 Cx43 loxP/loxP_Lyz-Cre/+、Cx43 loxP/-_Lyz-Cre/+、Cx43 loxP/loxP和Cx43 loxP/-，各占約25%。子代中Cx43 loxP/loxP_Lyz-Cre/+為純合子，即Cx43-/-小鼠，見圖1，Cx43 loxP/-_Lyz-Cre/+為雜合子小鼠，均可為今后進一步研究骨髓中Cx43基因作用機制提供實驗動物模型。

2 Cx43基因敲除對小鼠其它器官的影響

對Cx43-/-小鼠其它組織或器官進行分析顯示，本研究采用的條件性基因敲除技術(shù)可選擇性敲除造血系統(tǒng)中Cx43基因的表達，其中外周血細胞中無Cx43表達，骨髓中仍有極少量的Cx43表達，可能是骨髓中的非造血細胞污染所致，而參與造血的脾臟和肝臟中Cx43的表達也顯著下調(diào)(P<0.01)。心臟Cx43表達則無影響，腎臟Cx43則有所上調(diào)，見圖2。

3 Cx43-/-小鼠經(jīng)5-FU處理后造血恢復緩慢

造血系統(tǒng)Cx43基因敲除的小鼠成年后外周血象分析并無明顯異常，但化療后小鼠的造血恢復顯著減緩，受損明顯。在藥物作用后10 d，野生型小鼠的血象已開始恢復，至15 d時已接近正常水平，而Cx43-/-小鼠則無明顯的恢復跡象，其血紅蛋白、白細胞及血小板仍處低位，2者差別有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)，見圖3。體外集落實驗也證實Cx43-/-小鼠造血干/祖細胞增殖能力下降，其CFU-GM或CFU-E集落數(shù)均明顯少于野生型小鼠(P<0.01)，提示Cx43-/-小鼠骨髓造血細胞增殖受損，造血系統(tǒng)應(yīng)急能力下降，從而使造血重建延緩，見圖4。

Figure 1. The expression ofCx43 gene in hybrid mice as determined by PCR assay. M: marker; Cre: products ofCregene; loxP: products ofloxPgene. The number represented for the mice screened in this study.n=138.

圖1PCR法篩選和鑒定Cx43-/-和Cx43+/+小鼠

Figure 2.The relative mRNA expression of Cx43 from different tissues ofCx43-/-andCx43+/+mice determined by qPCR.Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCx43+/+group.

圖2qPCR法檢測Cx43-/-小鼠不同組織中Cx43表達

4 Cx43-/-小鼠免疫細胞發(fā)育異常

Cx43-/-小鼠在骨髓移植后其外周血細胞流式細胞術(shù)分析提示其免疫細胞發(fā)育異常，外周血中CD4+CD8+雙陽性細胞比例較野生型小鼠增多(P<0.05)，但CD4+T細胞則顯著減少(P<0.01)，尤其是TCRαβ亞群細胞減少最為明顯(P<0.01)。同樣，B細胞發(fā)育也受影響，外周血中CD45R+sIgM-細胞亞群比例與野生型小鼠相比顯著減少(P<0.01)，見圖5。

Figure 3.The peripheral blood cell counts ofCx43-/-andCx43+/+mice before and at different time points post 5-FU administration. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsCx43-/-group.

圖3Cx43-/-和Cx43+/+小鼠經(jīng)5-FU處理后不同時點的血象變化

5 Cx43-/-小鼠經(jīng)5-FU處理或骨髓細胞移植后骨髓造血細胞減少

與野生型小鼠對比，Cx43-/-小鼠無論化療或移植后其骨髓造血功能重建均延遲，14 d時骨髓切片及涂片均證實其骨髓中造血細胞增生程度明顯低于野生型小鼠，脂肪組織顯著增多，見圖6。Cx43-/-小鼠骨髓細胞的流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)其骨髓中Lin-/c-Kit+/Sca-1+細胞亞群與野生型小鼠相比差異并無統(tǒng)計學顯著性，其T、B淋巴細胞與外周血檢測結(jié)果相似，但B系CD45R+sIgM-細胞亞群和CD4+T細胞亞群則顯著減少(P<0.01)，提示敲除造血細胞Cx43基因后，盡管造血/干祖細胞數(shù)量未見明顯減少，但其增殖明顯減緩，致使造血重建延遲并使其體液和細胞免疫功能受損。

Figure 4.Colony-forming-unit (CFU) content of bone marrow cells inCx43-/-andCx43+/+mice at 14 d post bone marrow transplantation. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCx43-/-group.

圖4移植后第14天Cx43-/-和Cx43+/+小鼠骨髓中集落形成變化

Figure 5.The proportion changes of T and B lineage cells subgroups inCx43 knock out/wild type mice. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vsCx43-/-group.

圖5Cx43-/-和Cx43+/+小鼠外周血中T和B淋巴細胞數(shù)量變化

討 論

已確認人類不同組織中表達數(shù)十個不同亞型的Cx，不同基因缺陷可導致不同的疾病[7]。Presley等[8]結(jié)果顯示Cx43對正常造血的支持尤為重要，是骨髓基質(zhì)參與調(diào)控造血干/祖細胞生長的重要環(huán)節(jié)。在本研究中，我們采用條件性基因敲除技術(shù)選擇性敲除造血細胞中Cx43基因表達，經(jīng)篩選建立獲得Cx43基因表達缺失的小鼠模型，采用qPCR證實Cx43-/-小鼠骨髓造血細胞不表達該分子，且參與造血的相關(guān)組織如肝臟和脾臟中Cx43基因表達也顯著下調(diào)，其它部位Cx43表達與對照相似，提示采用本方案所獲Cx43-/-小鼠模型是可靠的。

Figure 6.Bone marrow biopsy with HE staining at 14 d post bone marrow transplantation ofCx43-/-andCx43+/+mice.

圖6移植后第14天Cx43+/+和Cx43-/-小鼠骨髓切片HE染色的形態(tài)學變化

現(xiàn)有的研究[9-11]發(fā)現(xiàn)Cx43在多種腫瘤細胞中呈高表達，并與細胞的遷移和藥物敏感性相關(guān)。我們先前的研究也發(fā)現(xiàn)Cx43分子通過與骨髓基質(zhì)細胞的相互作用影響多發(fā)性骨髓瘤細胞遷移、增殖和耐藥性[12-14]。盡管有證據(jù)[15]表明Cx43表達是維持正常造血所必需，但骨髓中何種細胞表達的Cx43發(fā)揮關(guān)鍵作用尚未確定。本研究采用Cx43-/-小鼠模型，在化療及移植層面分別觀察了Cx43基因敲除對骨髓造血重建的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該類小鼠成年后外周血無異常，但經(jīng)5-FU處理后，其血象恢復緩慢，提示其造血應(yīng)急能力減弱。移植實驗也有相似結(jié)果，有趣的是該類小鼠骨髓細胞流式細胞術(shù)分析并未發(fā)現(xiàn)其造血干/祖細胞亞群即Lin-/ c-Kit+/Sca-1+較野生型小鼠有明顯減少。同時，體外集落試驗發(fā)現(xiàn)Cx43-/-小鼠骨髓細胞CFU-GM或CFU-E集落數(shù)均明顯少于野生型小鼠，提示Cx43-/-小鼠骨髓造血細胞增殖受損，從而使造血重建延緩。Foss等[16]采用Cx43基因敲除的雜合子小鼠(Cx43-/+)進行研究時也有相似發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果證實造血細胞表達的Cx43分子與骨髓微環(huán)境中其它細胞形成的GJ在維持造血細胞增殖、分化中具重要作用。

免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟是機體抵抗外源微生物入侵的重要保障，本研究證實Cx43分子在免疫細胞發(fā)育過程中具重要作用，Cx43-/-小鼠經(jīng)化療或移植后其外周血免疫細胞異常，與野生型小鼠相比，其CD4+T細胞顯著減少，尤其是TCRαβ亞群細胞減少最為明顯，但CD4+CD8+雙陽性細胞則增多。對B細胞的分析也有類似結(jié)果，外周血中CD45R+sIgM-細胞亞群比例與野生型小鼠相比顯著減少。研究證實[17-19]骨髓基質(zhì)細胞表達Cx43，而表達Cx43的造血干/祖細胞可與基質(zhì)細胞相互作用，通過旁分泌或自分泌的形式調(diào)節(jié)造血干/祖細胞的增殖與分化，并最終影響免疫細胞的發(fā)育與成熟。鑒此，本研究結(jié)果證實敲除造血系統(tǒng)中Cx43基因后，盡管造血干/祖細胞數(shù)量未見明顯減少，但增殖明顯減緩，應(yīng)急能力減弱，致使造血重建延遲的同時尚可使其免疫功能受損。