方欽正， 徐 芳， 葉 林， 菅永志， 王維山， 史晨輝△

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科中心, 2石河子市人民醫(yī)院眼科， 新疆 石河子 832000)

骨硬化蛋白(sclerostin，SOST)是由SOST基因編碼的分泌型糖蛋白，通過與細(xì)胞表面的低密度脂蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合受體(LRP4/5/6)結(jié)合抑制 Wnt 信號(hào)通路，進(jìn)而抑制骨形成[1]。目前，雖然有研究認(rèn)為骨硬化蛋白的分泌與甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)和機(jī)械刺激等相關(guān)[1-2]，然而調(diào)控SOST基因表達(dá)的機(jī)制仍然不清楚。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一種內(nèi)源性、非編碼的單鏈小分子RNA，在物種間具有高度保守性，大小約為22個(gè)核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)[3]。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-218-5p通過調(diào)控Wnt 信號(hào)通路影響乳腺癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移[4]。本研究通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)并用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-218-5p與SOST的靶向關(guān)系，進(jìn)一步檢測(cè)miR-218-5p對(duì)SD大鼠成骨細(xì)胞骨硬化蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。

材 料 和 方 法

1 主要試劑與儀器

293T細(xì)胞株(廣州萊德爾生物科技有限公司)；限制性內(nèi)切酶、SYBR Green qPCR SuperMix和Lilpofectamine 2000 (Invitrogen)；質(zhì)粒提取試劑盒(廣東更順科技股份有限公司)；Phusion DNA聚合酶(Promega)；DNA凝膠純化試劑盒和DNA產(chǎn)物純化試劑盒(東盛生物科技有限公司)；序列測(cè)定(上海生工生物公司)；miRNA mimc(廣州萊德爾生物科技有限公司)；BCA法蛋白含量檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物發(fā)展有限公司)。ABI 7500熒光PCR儀(ABI)；核酸蛋白測(cè)定儀(Eppendorf)；Dual-Luciferase Assay System和GloMax生物發(fā)光檢測(cè)儀(Promega)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

293T細(xì)胞株購(gòu)自廣州萊德爾生物科技有限公司，于OPTI-MEM培養(yǎng)基5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。成骨細(xì)胞取于 4周齡SD大鼠脛骨平臺(tái)軟骨下骨組織，誘導(dǎo)分離并純化，茜素紅染色鑒定，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(培養(yǎng)條件為5% CO2、飽和濕度、37 ℃)。

3 方法

3.1生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 采用RNAhybrid和TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-218-5p靶向SOST基因的作用位點(diǎn)。

3.2細(xì)胞總RNA提取及real-time PCR 帶XhoI酶切位點(diǎn)的上游引物序列為5’-GATCGCTCGAGAGGAGTGGGAGCTTGAGTCC-3’，帶Not I酶切位點(diǎn)的下游引物序列為5’-GCGGCCAGCGGCCGCTCTCCTG CCGGAGTTTCATTG-3’ 。依據(jù) TRIzol 試劑說明書的操作步驟提取目的細(xì)胞的總 RNA，按照microRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作進(jìn)行細(xì)胞 cDNA的合成，按照熒光定量 PCR 試劑盒說明書進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)。 應(yīng)用 2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

3.3miRNA 寡核苷酸序列的合成 rno-miR-218-5p的 成 熟 體 序 列 (mimic) 、 rno-miR-218-5p抑制物(inhibitor)，以及相應(yīng)的陰性對(duì)照(mimic NC和inhibitor NC)均由蘇州金唯智生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。

3.4載體構(gòu)建 SOST 3’-UTR psiCHECK-2載體：根據(jù)PubMed GenBank NC_005109.4確定SOST基因3’-UTR，設(shè)計(jì)并合成引物(蘇州金唯智生物科技有限公司完成)，經(jīng)雙酶切、純化，與psiCHECK-2載體進(jìn)行酶連接。Mut-SOST 3’-UTR psiCHECK-2載體：突變生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-218-5p靶向SOST 3’-UTR的作用位點(diǎn)，同上方法構(gòu)建。送上海生工生物公司測(cè)序鑒定載體構(gòu)建的正確性。

3.5雙螢光素酶基因報(bào)告活性檢測(cè) 293T細(xì)胞鋪板，24 h后用Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。rno-miR-218-5p mimic、 rno-miR-218-5p inhibitor、rno-miR-218-5p mimic NC和rno-miR-218-5p inhibitor NC的濃度是20 nmol/L，重組雙螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒0.5 μg，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后處理細(xì)胞，用Promega的Dual-Luciferase Reporter Assay System (E1910)進(jìn)行樣品Luciferase活性檢測(cè)。

3.6核轉(zhuǎn)染 采用陽離子脂質(zhì)體法分別將rno-miR-218-5p mimic、 rno-miR-218-5p inhibitor、rno-miR-218-5p NC和rno-miR-218-5p inhibitor NC轉(zhuǎn)染入SD大鼠成骨細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞并開始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.7RT-PCR檢測(cè)SOST mRNA表達(dá)水平 用TRIzol試劑從SD大鼠成骨細(xì)胞中提取總RNA，取相同質(zhì)量總RNA 1 μL，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以5.0 μL cDNA(1∶20稀釋)為模板，在20 μL體系中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。SOST 的上游引物序列為5’-TGCCAAGCCGGTCACCGAGTT-3’，下游引物序列為5’-ACGCGCCCGATGGCGTTGGGC-3’； GAPDH的上游引物序列為5’-TGGCCGTGGGGCTGCCCAG-3’，下游引物序列為5’-GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3’。PCR條件為： 50 ℃ 2 min;95 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 32 s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物1.2%瓊脂凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

3.8Western blot 法檢測(cè)SD大鼠成骨細(xì)胞SOST的蛋白表達(dá) 細(xì)胞去除培養(yǎng)基，加入適量的蛋白裂解液，提取蛋白， BCA 法進(jìn)行蛋白定量。 10% SDS-PAGE，80 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)至分離膠后，120 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)剛出膠底部止，PVDF膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移，加入抗 SOST的I 抗，4 ℃ 孵育過夜，加入II抗，37 ℃孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)分析結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-218-5p 靶向SOST

生物信息學(xué)軟件RNAhybrid和TargetScan預(yù)測(cè)miR-218-5p靶向SOST基因， SOST 3’-UTR的第1 360～1 366個(gè)堿基(AAGCACA)與miR-218-5p的第14～20個(gè)堿基(UUCGUGUU)互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，此位點(diǎn)序列在物種間高度保守，見圖1。

Figure 1. The putative miR-218-5p binding site in 3’-UTR of SOST.

圖1SOST3’-UTR存在miR-218-5p的結(jié)合位點(diǎn)

2 miR-218-5p對(duì)SOST 3’-UTR的調(diào)控

成功構(gòu)建SOST 3’-UTR psiCHECK-2和Mut-SOST 3’-UTR psiCHECK-2載體，送上海生工生物公司測(cè)序進(jìn)行BLAST 分析證明序列正確。將rno-miR-218-5p mimic、 rno-miR-218-5p inhibitor、rno-miR-218-5p NC和rno-miR-218-5p inhibitor NC與SOST 3’-UTR psiCHECK-2/Mut-SOST 3’-UTR psiCHECK-2分別共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞，結(jié)果顯示rno-miR-218-5p mimic/SOST 3’-UTR psiCHECK-2共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的螢光素酶活性顯著下調(diào)，rno-miR-218-5p inhibitor/ SOST 3’-UTR psiCHECK-2共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的螢光素酶活性明顯上調(diào)，而轉(zhuǎn)染Mut-SOST 3’-UTR psi-CHECK-2細(xì)胞的螢光素酶活性均未見變化，驗(yàn)證miR-218-5p能特異性作用于SOST的3’UTR，見圖2。

Figure 2.The regulatory effect of miR-218-5p on SOST 3’-UTR detected by dual-luciferase reporter assay. The 293T cells were co-transfected with rno-miR-218-5p mimic, mimic NC, rno-miR-218-5p inhibitor or inhibitor NC, and SOST 3’-UTR psiCHECK-2 or Mut-SOST 3’-UTR psiCHECK-2. R/F: the ratio of the activity ofRenillaluciferase to firefly luciferase. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group;##P<0.01vsmimic group.

圖2miR-218-5p對(duì)SOST3’-UTR的調(diào)控

3 miR-218-5p對(duì)SD大鼠成骨細(xì)胞SOST表達(dá)的影響

為了研究miR-218-5p對(duì)SD大鼠成骨細(xì)胞SOST表達(dá)的影響，我們?cè)O(shè)立了rno-miR-218-5p mimic組、 rno-miR-218-5p inhibitor組及陰性和空白對(duì)照，以GAPDH為內(nèi)參照，檢測(cè)了SOST在mRNA和蛋白水平的表達(dá)差異。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染rno-miR-218-5p可明顯抑制SOST的mRNA和蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染rno-miR-218-5p inhibitor可明顯增強(qiáng)SOST的mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The exogenous miR-218-5p significantly decreased the mRNA (A)and protein (B) expression of SOST. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖3miR-218-5p對(duì)SD大鼠成骨細(xì)胞SOST表達(dá)的影響

討 論

骨硬化蛋白作為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的抑制劑成為近年來骨病研究中的熱點(diǎn)之一[5]，文獻(xiàn)報(bào)道骨硬化蛋白在骨質(zhì)疏松、惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[5-6]，近期也有文獻(xiàn)報(bào)道骨硬化蛋白可以延緩軟骨降解、抑制軟骨下骨硬化進(jìn)而影響骨關(guān)節(jié)炎的形成和發(fā)展[7-9]。本課題組前期研究也表明骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨較正常軟骨下骨中骨硬化蛋白表達(dá)明顯減少。文獻(xiàn)報(bào)道機(jī)械刺激、PTH和sirtuin 1可能是調(diào)控骨硬化蛋白表達(dá)的因素[1-2, 10]，但具體機(jī)制尚不明確。miRNA屬于小RNA的一種，主要通過直接調(diào)控其下游特異性靶基因的表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)功能，已有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA可能參與了骨硬化蛋白的調(diào)控表達(dá)[4, 6]。本研究前期通過靶基因在線預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(TargetScan、miRanda和miRDB)發(fā)現(xiàn)，miR-218-5p潛在靶向SOST基因，使用RNAhybrid和TargetScan進(jìn)行生物信息學(xué)分析，SOST 3’-UTR的第1 360～1 366個(gè)堿基(AAGCACA)與miR-218-5p的第14～20個(gè)堿基(UUCGUGUU)互補(bǔ)，此位點(diǎn)序列在物種間高度保守。由此預(yù)測(cè)miR-218-5p可能參與了骨硬化蛋白表達(dá)的調(diào)控。本研究通過構(gòu)建SOST基因3’-UTR野生型及突變型螢光素酶報(bào)告載體，與miR-218-5p質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-218-5p質(zhì)粒和SOST 3’-UTR野生型共轉(zhuǎn)染可使細(xì)胞螢光素酶活性明顯下降，而與SOST 3’-UTR突變型轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞螢光素酶活性沒有影響。這說明miR-218-5p可通過與SOST 3’-UTR的互補(bǔ)位點(diǎn)相互作用，調(diào)節(jié)靶蛋白的表達(dá)。

骨硬化蛋白主要由骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分泌，為了探討miR-218-5p在成骨細(xì)胞中調(diào)節(jié)骨硬化蛋白表達(dá)的作用，我們培養(yǎng)了SD大鼠成骨細(xì)胞并通過茜素紅染色鑒定，設(shè)立了miR-218-5p模擬物、抑制劑和陰性及空白對(duì)照，轉(zhuǎn)染SD大鼠細(xì)胞后在mRNA和蛋白層面觀察蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-218-5p模擬物可明顯下調(diào)成骨細(xì)胞SOST的mRNA和蛋白表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-218-5p抑制劑可明顯上調(diào)SOST的mRNA和蛋白表達(dá)。

綜上所述，本研究表明miR-218-5p可以通過靶向SOST基因，調(diào)控SOST蛋白的表達(dá)，進(jìn)而可能會(huì)影響骨代謝。此結(jié)果為本課題組后期進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-218-5p通過調(diào)節(jié)軟骨下骨骨重塑進(jìn)而延緩骨關(guān)炎提供了基礎(chǔ)依據(jù)，也為骨性關(guān)節(jié)炎的治療提供了可能新靶點(diǎn)。