鄭惠娜 ， 張 凱 ， 周春霞 ， 曹文紅 ， 高加龍 ， 鄭周彬 ，魏 薇 ， 秦小明 ， 章超樺

（1.廣州海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué) 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088；3.廣東海洋大學(xué) 國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江），廣東 湛江 524088）

食品加工過程中，熱處理是引起食品成分發(fā)生變性，導(dǎo)致食品物理化學(xué)特性發(fā)生改變的重要原因。動物肌肉加工過程中，蛋白質(zhì)是最易受熱而發(fā)生變性的成分，并且相比于植物蛋白和陸地動物蛋白，水產(chǎn)肌肉蛋白更為不穩(wěn)定，更易受熱而發(fā)生變性，大量研究顯示，肌肉蛋白經(jīng)過熱處理后其分子結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)特性等均會在加熱和受熱過程中發(fā)生明顯的變化[1-6]。因此，在食品加工過程中，為了防止蛋白質(zhì)因各種加工因素的影響，常常添加一些親水性膠體，這些膠體能與食品中的蛋白質(zhì)相互作用，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，質(zhì)地和物理化學(xué)性質(zhì)[7-11]。我國水產(chǎn)加工技術(shù)相對落后，特別是基礎(chǔ)研究起步較晚，水產(chǎn)資源及其副產(chǎn)品的加工利用率一直處于較低水平，導(dǎo)致長期以來我國水產(chǎn)加工產(chǎn)品單一，高值化加工產(chǎn)品較少。因此，加強基礎(chǔ)性研究，提升水產(chǎn)高值化加工技術(shù)水平，對于充分開發(fā)和利用我國豐富的水產(chǎn)及副產(chǎn)品資源十分必要。作者以珍珠產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物馬氏珠母貝肉為研究對象，在前期研究結(jié)果基礎(chǔ)上[12]，篩選出有效提高馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白熱穩(wěn)定性親水膠體，并分析不同熱處理條件下最佳親水膠體分子對馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響，研究結(jié)果為進一步開發(fā)利用馬氏珠母貝肉以及改善水產(chǎn)肌肉蛋白熱穩(wěn)定性，提高水產(chǎn)資源及副產(chǎn)品加工利用率、充分開發(fā)利用我國水產(chǎn)資源提供理論基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬氏珠母貝:購于湛江雷州市珍珠養(yǎng)殖場。

1.2 試劑與儀器

考馬斯亮藍試劑盒:購于南京建成生物工程研究所；福林酚試劑盒，十二烷基苯磺酸鈉（SDS），三羥甲基氨基甲烷（Tris），溴酚藍，R-250考馬斯亮藍:購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司；丙烯酰胺（Acr-Bis），過硫酸銨，四甲基乙二胺（TEMED），電泳上層膠緩沖液，電泳下層膠緩沖液:購于碧云天生物技術(shù)有限公司；卡拉膠，果膠，瓜爾膠:購于美國Sigma公司，其余試劑均為分析純。

JA2003電子天平:上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；JYL-F20絞肉機:九陽股份有限公司產(chǎn)品；T-18高速勻漿機:德國IKA公司產(chǎn)品；J-26S XP高速臺式冷凍離心機:美國貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品；DYY-6C電泳儀:北京六一儀器廠制造；DYCZ-24DN雙垂直電泳槽:北京六一儀器廠制造；PHS-3C數(shù)顯pH酸度計:上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；UV-2550紫外可見分光光度計:日本島津公司產(chǎn)品；DK-8D三孔三溫水浴鍋:常州諾基儀器有限公司產(chǎn)品；Bio-Rad ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng):美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理 馬氏珠母貝肉去殼，去內(nèi)臟取閉殼肌，清洗瀝干，每袋500 g分裝，置于-40℃凍藏備用。

1.3.2 水溶性蛋白質(zhì)的提取 水溶性蛋白質(zhì)提取參考文獻[12]略加修訂，取凍藏馬氏珠母貝肌肉于4℃下解凍16 h，稱取一定量貝肉絞肉機絞碎后，按照1 g∶4 mL比例加入超純水（4℃ 預(yù)冷），高速分散機勻漿3 min（冰浴條件下），然后10 000 r/min，4℃離心20 min，取上清液為粗提馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白質(zhì)。進一步按照50 g/dL比例加入硫酸銨，并于4℃靜置過夜后 10 000 r/min，4℃離心15 min，取沉淀，4℃下透析脫鹽直至采用BaCl2檢測無沉淀，既得馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白質(zhì)（WSP），進一步冷凍干燥后獲得粉末狀水溶性蛋白質(zhì)（F-D WSP）。

1.3.3 蛋白質(zhì)濃度測定 樣品蛋白質(zhì)濃度采用福林酚試劑盒進行測定。以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.001 3x+0.001 3，R2=0.998，y為吸光值，x則為樣品濃度。

1.3.4 有效親水膠體的篩選 選取卡拉膠、果膠、瓜爾膠3種親水膠體，采用0.05 mol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液將水溶性蛋白質(zhì)WSP配成1 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。同時，將3種親水膠體配成1 mg/mL的膠體溶液，然后將蛋白質(zhì)溶液與膠體溶液以體積比10∶1的比例混合均勻，將10 mL混合液及蛋白溶液分裝于玻璃試管中，在 60、70、80、90、100 ℃ 溫度條件下分別水浴熱處理30 min，無添加膠體的蛋白質(zhì)溶液也在同樣熱處理條件進行處理，樣品經(jīng)過熱處理后迅速冷卻至室溫，并于600 nm波長下測定熱處理后蛋白質(zhì)溶液及蛋白質(zhì)膠體混合溶液吸光值A(chǔ)及A′，樣品的濁度以透光率T和T′表示。通過比較在同一熱處理溫度和加熱時間條件下，蛋白質(zhì)溶液濁度與蛋白質(zhì)膠體混合溶液濁度差異（透光率差值ΔT），篩選出有效提高馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白熱穩(wěn)定性親水膠體。根據(jù)下式計算ΔT%:

其中:A為熱處理后水溶性蛋白質(zhì)溶液吸光值；A′為熱處理后水溶性蛋白質(zhì)膠體混合溶液吸光值；T為熱處理后水溶性蛋白質(zhì)溶液透光率；T′為熱處理后水溶性蛋白質(zhì)膠體混合溶液透光率。

1.3.5 有效親水膠體-蛋白質(zhì)混合體系熱處理 根據(jù)1.3.4篩選出最佳提高水溶性蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性親水膠體，采用0.05 mol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液將WSP配成1 mg/mL（福林酚法定量）的蛋白質(zhì)溶液，D-F WSP溶解后先4 000 r/min離心5 min取上清液，福林酚法定量配成1 mg/mL蛋白質(zhì)溶液。根據(jù)1.3.4程序進行熱處理，同時比較同樣熱處理條件下最佳親水膠體對WSP和D-F WSP蛋白質(zhì)溶液熱穩(wěn)定性的影響差異。

1.3.6 SDS-PAGE分析 將水溶性蛋白質(zhì)（WSP和F-D WSP）配成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，按照樣品溶液:加樣緩沖液體積比例5∶1混合均勻后，水浴煮沸5 min。采用濃縮膠5 g/dL，分離膠12 g/dL進行SDS-PAGE電泳分離，先恒壓80 V分離30min后改為恒壓160 V分離直至條帶前沿電泳至接近分離膠底部處，關(guān)閉電源，小心取下凝膠，切除濃縮膠部分，采用考馬斯亮藍染色均勻后，脫色液脫色直至凝膠底色透明，出現(xiàn)清晰條帶，于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中成像分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析與處理 實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5.0（GraphPad Software，Inc.La Jolla，CA USA）和 SPSS 22.0（IBM Inc.，NY，USA）進行作圖分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±SD（n=3），多組數(shù)據(jù)之間采用單因素ANOVA進行顯著性差異（P＜0.05）分析，兩組數(shù)據(jù)之間采用獨立樣本T檢驗進行顯著性差異（P＜0.05）分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 有效親水膠體的篩選

肌肉蛋白可以根據(jù)溶解度的差異分為水溶性蛋白（又稱肌漿蛋白）、鹽溶性蛋白（又稱肌原纖維蛋白，主要是肌球蛋白、肌動蛋白和肌動球蛋白）和不溶性蛋白（又稱肌質(zhì)蛋白）[13]。前期研究結(jié)果顯示相對于鹽溶性蛋白，馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白的熱穩(wěn)定性較差[12]。

目前，親水膠體廣泛用于各種食品的加工過程中，其能夠通過增強食品組分凝膠特性、粘稠性、持水性等提高食品的加工特性?？ɡz、果膠及瓜爾膠是食品工業(yè)中常用的膠體種類，并且研究顯示這3種膠體對蛋白穩(wěn)定性起到一定作用[14-15]。作者通過測定不同溫度條件下3種膠體對馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白質(zhì)WSP的熱穩(wěn)定性的差異，篩選出最佳穩(wěn)定WSP的膠體種類，研究結(jié)果（見圖1）顯示:同一熱處理溫度條件下，3種膠體對WSP的熱穩(wěn)定性的影響存在明顯差異（P＜0.05），并且在熱處理溫度范圍內(nèi)（60～100℃），卡拉膠對于穩(wěn)定WSP的效果最好，添加卡拉膠能夠顯著降低WSP溶液在熱處理條件下的濁度值，提高WSP溶液的透光率。而效果相對較差的是果膠，瓜爾膠的穩(wěn)定效果最差。并且從圖中結(jié)果可以看出，隨著熱處理溫度的提高，ΔT逐漸增大，而這種趨勢在果膠及瓜爾膠數(shù)據(jù)結(jié)果中不明顯。蛋白質(zhì)的熱變性反應(yīng)十分復(fù)雜，隨著熱處理的條件及溫度不同會發(fā)生許多結(jié)構(gòu)變化，特別是各種熱處理條件對蛋白質(zhì)變性過程肽鏈的展開及蛋白質(zhì)凝聚反應(yīng)的強度不同，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在水溶液中發(fā)生熱變性時候，首先肽鏈展開后相互凝聚，蛋白質(zhì)溶液濁度提高，透光率減少，當(dāng)變性到一定程度時候，凝聚蛋白質(zhì)完全變性并在重力作用下發(fā)生沉淀，從而使溶解度下降[16-17]。研究結(jié)果顯示，在熱處理條件下，卡拉膠作為穩(wěn)定馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白WSP的效果最好。

圖1 不同溫度條件下3種親水膠體對水溶性蛋白WSP熱穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of three colloids on thermal stability of WSP at different

2.2 卡拉膠對水溶性蛋白熱穩(wěn)定性的影響

2.2.1 WSP與F-D WSP蛋白質(zhì)溶液組成差異比較貝肌肉水溶性蛋白質(zhì)主要含有肌漿蛋白、球蛋白和肌白蛋白，大多數(shù)的水溶性蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量在1～10萬范圍內(nèi)，分子形狀近似球形[18-19]。研究過程中發(fā)現(xiàn)冷凍干燥后的水溶性蛋白質(zhì)F-D WSP的溶解性較差，難以完全溶解，因此，WSP與F-D WSP可溶蛋白質(zhì)溶液組成是否有所不同需要進行分析。圖2比較了WSP和F-D WSP蛋白質(zhì)溶液的蛋白組成差異，從圖中結(jié)果分析:未經(jīng)過冷凍干燥的水溶性蛋白質(zhì)WSP條帶數(shù)較冷凍干燥的水溶性蛋白質(zhì)F-D WSP多，經(jīng)過冷凍干燥，能夠溶解于緩沖溶液中的F-D WSP蛋白質(zhì)條帶主要分布在 9.9×104、6.5×104、4.2×104、3.6×104以及 1.8×104附近。 而未經(jīng)過冷凍干燥的WSP水溶液蛋白條帶較多，并且與F-D WSP相比較，主要體現(xiàn)在 1.5×105及 8.0×104附近的相對分子質(zhì)量較大蛋白質(zhì)，這可能是由于冷凍干燥過程中相對分子質(zhì)量較大蛋白更容易發(fā)生冷凍變性從而溶解性大大降低，以至于冷凍干燥后在緩沖溶液中無法溶解。

圖2 WSP與F-D WSP蛋白溶液組成差異比較Fig.2 Comparison of the protein compositions between WSP and F-D WSP solution

圖3 60℃熱處理條件下卡拉膠對WSP及F-D WSP熱穩(wěn)定性影響Fig.3 Effect of Carrageenan on thermal stability of WSP and F-D WSP under 60℃

2.2.2 卡拉膠對WSP及F-D WSP熱穩(wěn)定性的影響為進一步研究卡拉膠對馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白的影響作用，作者同時比較了卡拉膠對未經(jīng)過冷凍干燥的水溶性蛋白質(zhì)WSP及冷凍干燥后的水溶性蛋白F-D WSP熱穩(wěn)定性影響作用的差異性，研究結(jié)果見圖3-圖7，從圖3及圖4結(jié)果分析，在60℃和70℃熱處理條件下及熱處理時間范圍內(nèi) （5～30 min）卡拉膠對F-D WSP和WSP的熱穩(wěn)定性作用存在明顯差異，在同一處理時間條件下，卡拉膠對F-D WSP的穩(wěn)定作用明顯優(yōu)于對WSP的穩(wěn)定作用，這可能是冷凍干燥后，水溶性蛋白質(zhì)本身已經(jīng)發(fā)生了一定的變性，親水性較差，溶解于水溶液中再經(jīng)過熱處理更容易發(fā)生凝聚，從而更不穩(wěn)定，這使得卡拉膠的穩(wěn)定作用尤為明顯，未經(jīng)過冷凍干燥處理的WSP蛋白質(zhì)在60℃及70℃條件下相對穩(wěn)定性較好。圖5結(jié)果顯示了80℃條件下，卡拉膠對WSP的穩(wěn)定作用開始增強，而對F-D WSP的穩(wěn)定作用有所減弱，并且隨著熱處理溫度的提高，卡拉膠對WSP的穩(wěn)定作用開始優(yōu)于對F-D WSP的穩(wěn)定作用。這可能是由于在較高溫條件下，經(jīng)過冷凍干燥處理的F-D WSP易于發(fā)生進一步變性凝聚，此時卡拉膠的穩(wěn)定作用已經(jīng)不能較為有效抑制FD WSP熱變性進程。卡拉膠是一類多糖類物質(zhì)，各種類型的卡拉膠結(jié)構(gòu)中均含有大量的羥基。Fuente等研究顯示在卡拉膠存在條件下，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的乳清蛋白溶液在pH7.0溶液中進行熱處理，乳清蛋白不會失去其天然結(jié)構(gòu)，但是會引起加熱過程中所形成的可溶性聚集物相對分子質(zhì)量降低[20]。Kelly等研究也顯示，卡拉膠的存在不影響在75℃時加熱的乳清蛋白的聚集，然而，在較高溫度下，卡拉膠的存在對乳清分離蛋白的聚集產(chǎn)生較大影響[21]。蛋白質(zhì)種類及存在的狀態(tài)不同，卡拉膠與其相互作用的機制也不同，整體分析，隨著熱處理溫度的不斷提高，卡拉膠對未經(jīng)過冷凍干燥處理的WSP穩(wěn)定性作用逐漸增強，而對經(jīng)過冷凍干燥處理的F-D WSP的穩(wěn)定性作用則呈先增強后減弱的趨勢。

圖4 70℃熱處理條件下卡拉膠對WSP及F-D WSP熱穩(wěn)定性影響Fig.4 Effect of Carrageenan on thermal stability of WSP and F-D WSP under 70℃

圖5 80℃熱處理條件下卡拉膠對WSP及F-D WSP熱穩(wěn)定性影響Fig.5 Effect of Carrageenan on thermal stability of WSP and F-D WSP under 80℃

圖6 90℃熱處理條件下卡拉膠對WSP及F-D WSP熱穩(wěn)定性影響Fig.6 Effect of Carrageenan on thermal stability of WSP and F-D WSP under 90℃

圖7 100℃熱處理條件下卡拉膠對WSP及F-D WSP熱穩(wěn)定性影響Fig.7 Effect of Carrageenan on thermal stability of WSP and F-D WSP under 100℃

3 結(jié) 語

親水膠體卡拉膠、果膠及瓜爾膠對提高馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白熱穩(wěn)定性具有一定的作用，其中卡拉膠的穩(wěn)定性作用效果最佳。經(jīng)過冷凍干燥后的水溶性蛋白溶液的蛋白組成與未經(jīng)過冷凍干燥的水溶性蛋白溶液蛋白組成存在一定差異，同時卡拉膠對其穩(wěn)定性作用也存在差異，在熱處理條件下，隨著熱處理溫度的不斷提高，卡拉膠對未經(jīng)過冷凍干燥處理的WSP穩(wěn)定性作用逐漸增強，而對經(jīng)過冷凍干燥處理的F-D WSP的穩(wěn)定性作用則呈先增強后減弱的趨勢。