單海雷，焦光美，竇志杰，馬 征，張曉璇，楊 寧，高燕軍

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北承德 067000)

腦梗死是世界范圍內(nèi)人群死亡的主要原因之一，也是導致長期神經(jīng)功能損傷的主要原因。多重因素導致的疾病復雜性阻礙腦梗死的診斷和治療[1]。雖然已開展許多有關(guān)腦梗死治療的臨床試驗，但目前血栓溶解仍是主要治療方法[2]。因此，迫切需要開發(fā)新的有效的診斷和治療方法。微RNAs(microRNAs，miRNAs)是生物體內(nèi)廣泛存在的含19～24個核苷酸的非編碼RNA，其可與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)域(3′UTR)結(jié)合，阻止它們的翻譯。miRNAs可調(diào)節(jié)多種細胞活動，如細胞增殖、分化、凋亡、器官發(fā)育、機體代謝和腫瘤發(fā)生。且近年來，許多研究已經(jīng)注意到miRNAs在腦梗死中的作用。腦缺血后，大腦中miRNAs的表達發(fā)生改變[3]。另外，有些miRNA在人體血清或血漿中穩(wěn)定存在，可以作為組織損傷和病理狀態(tài)的特異標志物[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-181家族中，miR-181a對小鼠的缺血性神經(jīng)損傷具有保護作用[5]，下調(diào)的miR-181b通過對熱休克蛋白A5(HSPA5)和UCHL1蛋白水平的負調(diào)控，誘導神經(jīng)保護對抗缺血性損傷，為缺血性腦卒中提供了一個潛在的治療靶點[6]。缺血后miR-181c直接作用于腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，從而調(diào)節(jié)小膠質(zhì)激活和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)元損傷[7]。然而，miR-181家族的第4個重要成員miR-181d在腦缺血中的作用還鮮有報道。本研究旨在通過檢測腦梗死患者和大腦中動脈阻塞(MCAO)模型小鼠血清中miR-181d的表達水平及其與炎癥的關(guān)系，初步揭示miR-181d在腦梗死中的作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1血清標本 采用回顧性研究方法，收集32例發(fā)病48 h內(nèi)入住承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院的腦梗死患者血清(腦梗死損傷組)，其中男21例，女11例，年齡34～73歲，平均(54.0±18.7)歲。另選取體檢正常的健康對照人群13例收集血清(對照組)，男9例，女4例，年齡38～69歲，平均(53.0±14.7)歲。所有患者采血前均未進行過擴容、擴血管及溶栓治療，無創(chuàng)傷及手術(shù)史；并且除外其他癌癥、感染或免疫疾病患者。兩組性別、年齡及高血壓、糖尿病、高血脂等并發(fā)癥比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究符合醫(yī)學倫理學標準，獲得患者或家屬的知情同意，同時經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.1.2小鼠MCAO模型 C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量為20～25 g，于22～24 ℃正常晝夜交替環(huán)境飼養(yǎng)。稱重后，按70 mL/kg腹腔注射5%水合氯醛。參照Longa線栓法建立小鼠左側(cè)MCAO模型。36只小鼠分為假手術(shù)組(n=6)和腦梗死組(n=30)。腦梗死組于梗死后1、3、7、14、28 d取材。

1.2方法

1.2.1血樣采集和血清總RNA提取 收集腦梗死患者發(fā)病48 h內(nèi)的靜脈血5 mL，置于含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中，4 ℃冰箱靜置30 min，3 000 r/min離心30 min，取上層血清置于無RNA酶離心管中，然后按照血清miRNA提取試劑盒說明書(北京天根生化科技有限公司)提取血清總RNA。

1.2.2細胞培養(yǎng) THP-1細胞購自美國ATCC公司。人胚腎HEK-293T細胞系購自CBTCCCAS。這些細胞均用DMEM培養(yǎng)基[含10%胎牛血清(FBS，購自美國Invitrogen公司上海分公司)]于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR) 從血清中提取的總RNA用TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit(美國Applied biosystem公司)和miR-181d特異性反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄成特異性產(chǎn)物。然后使用TaqMan miR-181d探針(美國Applied biosystem公司)在IQ5實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)上進行qRT-PCR。整個反應體系嚴格按照說明書進行。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 使用Abcam公司試劑盒(人TNF-α ELISA試劑盒ab46087；小鼠TNF-α ELISA試劑盒ab208348)檢測。使用每個樣品的3個平行樣進行統(tǒng)計分析。

1.2.5報告基因質(zhì)粒構(gòu)建 包含miR-181d潛在結(jié)合位點的人TNF-α 3′-UTR序列是通過PCR擴增獲得，以HEK-293T細胞的DNA為模板。突變質(zhì)粒采用上海碧云天生物技術(shù)有限公司的快速突變系統(tǒng)生成。PCR產(chǎn)物通過SgfI和PmeI位點連接到psiCHECK-2載體上(美國Promega公司)。插入片段的序列通過DNA測序證實。所用引物：TNF-α-3′-UTR-WT-正向：5′-GAC CGC GAT CGC CCA CTA AGA ATT CAA ACT G-3′；TNF-α-3′-UTR-WT-反向：5′-CTT AGT TTA AAC CGA TTA CAG ACA CAA CT-3′；TNF-α-3′-UTR-Mut-正向：5′-TTT ATT ATT TAT TTA TTT ACA GAA CTT ACA ATT TAT TTG-3′；TNF-α-3′-UTR-Mut-反向：5′-CAA ATA AAT TGT AAG TTC TGT AAA TAA ATA AAT AAT AAA -3′。

1.2.6熒光素酶報告基因檢測實驗 將含TNF-α 3′-UTR或其突變體的報告基因載體的psiChECK-2質(zhì)粒和miR-181d或?qū)φ漳M物一起，使用脂質(zhì)體2000試劑(美國Invitrogen公司)瞬時轉(zhuǎn)染到HEK-293T細胞中。48 h后，用被動裂解緩沖液100 μL(美國Promega公司)裂解細胞，然后按照Promega雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒說明書(美國Promega公司)檢測裂解液的熒光素酶表達水平(體系：20 μL；使用貝特霍爾德FB12光度計測量)。內(nèi)參為海腎熒光素酶。

1.2.7蛋白質(zhì)印跡法(Western blot) 細胞吸去上層細胞培養(yǎng)基后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3遍，然后加入RIPA裂解液，98 ℃變性10 min；用制備好的10%丙烯酰胺(SDS)膠板電泳(90 V電壓)；用硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜過夜(100 V，4 ℃)；脫脂牛奶常溫封閉2 h；用含2%牛奶的PBS配置一抗過夜孵育;1‰ TBST洗膜3遍，每遍10 min，用含2%牛奶的PBS配置二抗，和膜室溫孵育2 h；再用1‰ TBST清洗膜3遍，每遍15 min。加入辣根過氧化物酶底物，反應2 min，用上海勤翔ChemiScope 6000化學發(fā)光系統(tǒng)曝光。

A：血清miR-181d表達水平比較；B：血清TNF-α表達水平比較；C：miR-181d和TNFα表達水平的相關(guān)性分析

圖1 腦梗死組與對照組血清miR-181d和TNF-α的表達及相關(guān)性分析

A：血清miR-181d表達水平比較；B：血清TNF-α表達水平比較；C：小鼠MCAO模型血清miR-181d和TNF-α表達水平的相關(guān)性分析；*：P<0.01，與假手術(shù)組比較

圖2 小鼠MCAO模型血清miR-181d和TNF-α的表達和相關(guān)性分析

2 結(jié) 果

2.1miR-181d、TNF-α在腦梗死損傷組與對照組血清的表達變化及相關(guān)性 腦梗死損傷組患者血清miR-181d表達水平低于對照組(P=0.015 7)，見圖1A。與對照組比較，腦梗死損傷組患者血清TNF-α表達水平升高(P=0.038 8)，見圖1B。進一步對所有血清標本miR-181d和TNF-α表達水平進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明TNF-α和miR-181d的表達水平呈負相關(guān)(r=-0.703 8，P=0.000 4)，見圖1C。

2.2miR-181d和TNF-α在MCAO模型小鼠血清中的表達變化及相關(guān)性 利用qRT-PCR和ELSIA檢測假手術(shù)組和不同時段腦梗死組小鼠血清miR-181d和TNF-α的表達水平。結(jié)果表明，腦梗死組小鼠血清miR-181d表達水平低于假手術(shù)組，并且miR-181d表達水平隨著腦梗死發(fā)生時間的不斷增加而降低，見圖2A。與之相反，TNF-α在腦梗死組小鼠血清中的表達水平高于假手術(shù)組，并且隨著腦梗死發(fā)生時間的不斷增加而升高，見圖2B。在小鼠MCAO模型血清中，miR-181d和TNF-α的表達水平呈負相關(guān)(r=0.965 3，P=0.001 8)，見圖2C。

A：人類TNF-α 3′-UTR的miR-181d結(jié)合位點模式圖，突變序列顯示在下方； B：報告基因?qū)嶒灆z測miR-181d與TNF-α 3′-UTR的結(jié)合；C：100 nmol/L miR -181d的類似物轉(zhuǎn)染到野生型的THP-1細胞中，qRT-PCR檢測miR-181d的表達；D：miR -181d的類似物轉(zhuǎn)染到野生型的THP-1細胞中，Western blot檢測TNF-α的表達；*：P<0.01，與Ctrl mimics比較

圖3 miR-181d通過結(jié)合到3′-UTR抑制TNF-α表達

2.3miR-181d對TNF-α的抑制作用 通過在線分析軟件Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_71/)搜索發(fā)現(xiàn)miR-181d潛在與TNF-α的3′UTR的500～507 bp位置發(fā)生結(jié)合，且進化上高度保守(圖3A)。接下來構(gòu)建了野生型和突變型的TNF-α 3′UTR片段(針對miR-181d潛在結(jié)合位點)，并將它們連接到報告基因質(zhì)粒psiCHECK2上。然后同時轉(zhuǎn)染miR-181d 模擬物或?qū)φ漳M物及含TNF-α 3′UTR的報告基因質(zhì)粒于HEK-293T細胞中。檢測結(jié)果表明，miR-181d模擬物可以顯著抑制含野生型TNF-α 3′UTR的報告基因的活性，表明miR-181d可以與TNF-α 3′UTR結(jié)合。但是當miR-181d的潛在結(jié)合位點發(fā)生突變后，抑制作用減弱，說明這個結(jié)合位點對miR-181d來說，是十分重要的(圖3B)。進一步在THP-1細胞中過表達miR-181d(圖3C)，發(fā)現(xiàn)TNF-α的蛋白水平降低(圖3D)。

3 討 論

miRNA在腦發(fā)育和功能上起著十分關(guān)鍵的作用，血液循環(huán)中的大部分miRNA并不是從破碎的組織細胞被動漏出，而是從受損組織細胞主動分泌進入血液循環(huán)，并進入靶細胞發(fā)揮作用。本研究中結(jié)果顯示，腦梗死患者血清miR-181d的表達水平明顯低于健康對照人群。此外，本研究成功建立了小鼠MCAO模型，在MCAO模型小鼠中血清miR-181d水平明顯低于假手術(shù)組，并且隨著病程的延長持續(xù)降低。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)證實血清miR-181d的下調(diào)可以作為腦梗死的一個生物標志物。本研究的不足之處在于沒有確定血清miR-181d下調(diào)的原因。另一方面，由于本研究所使用的臨床病例數(shù)較少，其結(jié)論的推廣確立有待擴大樣本的前瞻性臨床研究證實。

研究表明炎癥是腦梗死的關(guān)鍵因素[8]，白細胞介素(IL)-1、IL-2、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)等炎性因子均參與了腦梗死的發(fā)生、發(fā)展[9-12]；腦梗死患者血清TNF-α、IL-2、TGF-β1等水平明顯升高，TNF-α、IL-2、TGF-β1可促進腦組織的炎性反應及血管斑塊的形成，上述炎性因子的表達水平與病情嚴重程度及梗死面積相關(guān)。本研究在腦梗死患者血清標本中同樣檢測到TNF-α表達水平升高。此外，在小鼠MCAO模型中血清TNF-α水平亦表現(xiàn)為上調(diào)。相關(guān)性分析顯示，在臨床樣本和小鼠模型中，miR-181d和TNF-α的表達均呈明顯負相關(guān)。說明miR-181d和TNF-α之間存在著潛在的調(diào)控關(guān)系。關(guān)于這一點，在其他的研究和體系中也得到證實。在星形膠質(zhì)細胞中，HUTCHISON等[13]研究發(fā)現(xiàn)敲除miR-181可以增強高遷移率組蛋白B1(HMGB1)的產(chǎn)生并促使脂多糖(LPS)誘導產(chǎn)生多種炎性因子，同時過表達miR-181會導致炎癥抑制因子IL-10的表達升高。DAN等[14]研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥多導致的免疫麻痹過程中，烏本苷可以通過誘導miR-181的轉(zhuǎn)錄，導致TNF-α mRNA水平的降解和蛋白水平的下調(diào)。然而，也有文獻報道，miR-181和TNF-α在功能上也有可能存在正向的協(xié)同作用。GHORBANI等[15]發(fā)現(xiàn)在小鼠成纖維細胞中，過表達miR-181可以增強TNF-α所誘導的線粒體膜電位的降低和隨后發(fā)生的細胞凋亡。本研究同時利用雙熒光酶報告基因和Western blot實驗證明miR-181d可以通過與TNF-α mRNA的3′-UTR 區(qū)域相結(jié)合來抑制TNF-α的表達。說明炎性細胞是血清中miR-181d作用的靶細胞之一。在正常的生理過程中，miR-181d的表達抑制炎性反應的發(fā)生。而在腦缺血疾病發(fā)生時，miR-181d的表達出現(xiàn)下調(diào)，血清中miR-181d的表達也隨之降低，后者的表達下降會導致炎性細胞中TNF-α表達的升高。也就是說，miR-181d的表達變化不僅可以作為臨床腦缺血性疾病的診斷和預后指標。同時過表達miR-181d不失為治療和改善腦梗死的一種潛在選擇。在后續(xù)的研究中，需要利用細胞和動物實驗進一步明確miR-181d在腦梗死過程中所發(fā)揮的功能。另一方面，miR-181d作為miRNA，可以參與調(diào)控多種信號通路的轉(zhuǎn)導，這方面有待進一步的研究。

miR-181家族共有miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d四個miRNA。它們分別由不同染色體區(qū)域轉(zhuǎn)錄而成，且序列上高度相似。有關(guān)4種亞型在腦缺血性疾病研究中的深入程度有所不同，以miR-181a的研究最多。如小鼠腦卒中后，miR-181a抑制劑的治療可以改善小鼠的行為學指標[5]。而OUYANG等[16]卻發(fā)現(xiàn)miR-181a可以通過靶向GRP78使腦缺血病情惡化。此外，MA等[17]研究表明在臨床腦卒中患者中miR-181c的表達升高，同時miR-181c可以促進神經(jīng)瘤母細胞Neuro-2a的凋亡。在小鼠MCAO模型中，miR-181類似物的處理可以降低小神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的激活并促進凋亡細胞的表達[7]。本研究檢測到腦梗死患者和小鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)模型血清miR-181d表達下調(diào)，血清TNF-α表達升高，并進一步在人胚腎細胞(HEK-293T)細胞和THP-1細胞中證明miR-181d可以抑制TNF-α的表達。結(jié)合前述報道，系統(tǒng)地闡明了miR-181家族各成員在腦缺血性疾病中的表達譜及其功能的差異。