周 龍，王立林，胡序懷，李亞文

(1.廣東省深圳市衛(wèi)生健康發(fā)展研究中心 518000；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院麻醉科，廣東深圳 518000；3.廣東省深圳市血液中心 518000)

胰島素抵抗可嚴(yán)重影響危重患者的預(yù)后[1-2]，丙泊酚是目前臨床上最常用的靜脈麻醉藥，廣泛用于危重患者的鎮(zhèn)靜或麻醉。丙泊酚可導(dǎo)致大鼠全身胰島素抵抗[3]，但其分子機制尚不清楚。筆者前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可引起小鼠原代肝細胞蛋白激酶B(Akt)和糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化水平降低，抑制小鼠原代肝細胞磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt/GSK-3β信號通路，抑制小鼠原代肝細胞糖原合成，從而引起小鼠原代肝細胞胰島素抵抗[4]。第10號染色體缺失性磷酸酶-張力蛋白同源物蛋白(PTEN)可從上游調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路[5-7]，在先前研究的基礎(chǔ)上[4]，筆者推測PTEN參與了丙泊酚所致的胰島素抵抗。本實驗將通過基因沉默，探討PTEN對小鼠原代肝細胞Akt/GSK-3β信號通路的影響，旨在評估研究丙泊酚所致胰島素抵抗分子機制時PTEN是否為一個值得驗證的對象，為進一步探索丙泊酚引起胰島素抵抗的分子機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 siRNA-996、陰性對照siRNA(上海吉瑪基因公司)。siRNA-996序列：5′-GGU GUA UAC AGG AAC AAU ATT-3′(正義鏈)，5′-UAU UGU UCC UGU AUA CAC CTT-3′(反義鏈)；陰性對照siRNA序列：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′(正義鏈)，5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′(反義鏈)。細胞培養(yǎng)試劑(美國Invitrogen公司)，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑(美國Bio-Rad Laboratories公司)，HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑盒(德國Qiagen公司)，Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、GSK-3β、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、兔抗PTEN抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司)。雄性C57BL/6小鼠(8周齡，22～32 g)由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供[許可證號：SCXK(京)2016-0010]。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 采用兩步膠原酶灌注法分離小鼠原代肝細胞[8-9]，1只小鼠能提供5×107～5×108個原代肝細胞，收集細胞于50 mL離心管中，800 r/min離心8 min，棄上清液，用細胞培養(yǎng)基重新懸浮，顯微鏡下臺盼藍染色觀察活細胞，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度，以適當(dāng)濃度接種培養(yǎng)瓶，于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2實驗分組 陰性對照組(NC-C組)：小鼠原代肝細胞中加入陰性對照siRNA(終濃度50 nmol/L)。陰性對照siRNA與siR-996有基本相同的堿基組成，但與靶mRNA無同源性。陰性對照siRNA進入細胞后不會引起基因表達的改變，能夠反映siRNA進入細胞后對基因表達的非特異影響。陰性對照IL-6組(NC-IL組)：NC-C組的基礎(chǔ)上加入IL-6(終濃度10 ng/mL)，用于檢測IL-6對Akt和GSK-3β磷酸化水平的影響。以及IL-6對PTEN蛋白表達的影響。siR-996對照組(996-C組)：小鼠原代肝細胞中加入siRNA-996(終濃度50 nmol/L)；siR-996與IL-6組(996-IL組)：小鼠原代肝細胞中加入siRNA-996和IL-6。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染的前1 d對小鼠原代肝細胞換液，計數(shù)活細胞，調(diào)整細胞密度，置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照HiPerFect試劑說明書，在24孔板中加入小鼠原代肝細胞(6×104個/孔)，用DMEM培養(yǎng)液(含100 U/mL青霉素、10%胎牛血清)稀釋至500 μL，置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中。用無血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋75 ng siRNA至5 nmol/L(終濃度)，然后加入3 μL HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑，室溫下靜置10 min，將混合物緩慢加入培養(yǎng)皿中，混勻，置于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.4蛋白檢測 用10% SDS-PAGE分離細胞裂解液，再將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h。加入一抗(以1∶1 000的濃度稀釋)，在搖床上緩慢搖動，孵育3 h，如果一抗在室溫下孵育效果不佳，可以改為在4 ℃下過夜；TBS-T洗膜，室溫振搖5 min，共洗滌3次，如果結(jié)果背景亮度較高可適當(dāng)延長洗滌時間或增加洗滌次數(shù)。洗膜后加入以辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(以1∶3 000的濃度稀釋)，與膜共同孵育1 h，TBS-T洗膜，室溫振搖5 min，共洗滌5次。在暗室中加入等體積混合發(fā)光緩沖液，均勻滴加到PVDF膜的蛋白面上，壓X光膠片1～10 min；顯影、定影，用Gel-Pro Analyzer分析蛋白條帶灰度。

2 結(jié) 果

2.1Akt磷酸化水平 與NC-C組相比，NC-IL組Akt磷酸化水平降低(P<0.05)，996-C組和996-IL組Akt磷酸化水平升高(P<0.05)，見圖1A、B。

2.2GSK-3β磷酸化水平 與NC-C組相比，NC-IL組GSK-3β磷酸化水平降低(P<0.05)，996-C組和996-IL組GSK-3β磷酸化水平升高(P<0.01)，見圖1A、C。

A：Western blot分析的蛋白條帶；B：IL-6和PTEN基因沉默對Akt磷酸化水平的影響；C：IL-6和PTEN基因沉默對GSK-3β磷酸化水平的影響；D：IL-6和PTEN基因沉默對PTEN蛋白表達的影響；*：P<0.05，#：P<0.01，與NC-C組比較；△：P<0.05，與996-C組比較

圖1 PTEN對小鼠原代肝細胞Akt/GSK-3β信號通路的影響

2.3PTEN蛋白水平 與NC-C組相比，NC-IL組PTEN蛋白水平升高(P<0.05)，996-C組和996-IL組PTEN蛋白水平降低(P<0.01)，996-IL組PTEN蛋白水平高于996-C組(P<0.05)，見圖1A、D。

3 討 論

IL-6是一種常見的細胞因子，有研究發(fā)現(xiàn)在NCTC-1469細胞中IL-6可抑制Akt/GSK-3β信號通路，抑制糖原合成，引起NCTC-1469細胞胰島素抵抗[10]。IL-6可通過誘導(dǎo)胰島素受體底物-1(IRS-1)降解或增加IRS-1絲氨酸磷酸化來抑制胰島素信號通路[11]。在本實驗中IL-6使小鼠原代肝細胞Akt磷酸化水平和GSK-3β磷酸化水平都降低，表明IL-6可抑制小鼠原代肝細胞Akt/GSK-3β信號通路。

PTEN于1997年被發(fā)現(xiàn)，是人類發(fā)現(xiàn)的第1個具有磷酸酶活性的抑癌基因，其編碼的蛋白在細胞質(zhì)中表現(xiàn)出雙重特異性磷酸酶活性，PTEN在細胞凋亡、細胞遷移、細胞周期阻滯過程中起關(guān)鍵性作用[12-13]。PTEN蛋白能夠募集到細胞膜上行使脂質(zhì)磷酸酶作用，還能使多種蛋白質(zhì)磷酸化，從而干預(yù)多條信號途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)，它還能在細胞核中對基因轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控[14-15]。PTEN是PI3K/Akt信號通路的重要調(diào)節(jié)基因，結(jié)合到質(zhì)膜上的PTEN可將3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)催化為4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，從而抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠原代肝細胞中IL-6可引起PTEN蛋白表達增強，進而抑制小鼠原代肝細胞Akt和GSK-3β磷酸化，從而抑制Akt/GSK-3β信號通路。而在小鼠原代肝細胞中PTEN基因沉默可抑制PTEN蛋白表達，使小鼠原代肝細胞Akt磷酸化水平和GSK-3β磷酸化水平都升高，顯示PTEN基因沉默可增強小鼠原代肝細胞Akt/GSK-3β信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，PTEN基因沉默還可逆轉(zhuǎn)IL-6所致的PTEN蛋白表達水平升高，使原本受IL-6抑制的Akt和GSK-3β磷酸化水平恢復(fù)到比抑制前更高的水平，表明PTEN基因沉默可逆轉(zhuǎn)IL-6對小鼠原代肝細胞Akt/GSK-3β信號通路的抑制。

綜上所述，PTEN基因沉默可增強小鼠原代肝細胞Akt/GSK-3β信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，并可逆轉(zhuǎn)IL-6對小鼠原代肝細胞Akt/GSK-3β信號通路的抑制，在研究丙泊酚引起胰島素抵抗的分子機制時PTEN是一個值得驗證的作用靶點。