沈艷花，牛成群，覃韋寧，李 珊，武福云

(湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北十堰 442000)

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)位于血管中膜，是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)及維持血管張力的主要細(xì)胞，并且在多種生理過程中發(fā)揮重要作用。VSMCs的增殖分化與血管發(fā)育、血管損傷修復(fù)和血管重塑等密切相關(guān)[1]。而異常的VSMCs增殖可造成許多病理性損傷，如動脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄和高血壓血管重塑等心血管疾病[2-4]。中草藥在治療心血管疾病方面具有獨特的優(yōu)勢，如益氣活血化瘀的中藥丹參[5]。丹參的主要提取物包括脂溶性的丹參酮和水溶性的丹酚酸類[6]。以往研究表明，丹參酮能夠抑制VSMCs增殖，具有抗動脈粥樣硬化的作用，而丹酚酸對VSMCs及內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[7-8]。除此之外，中草藥活性蛋白在心血管疾病方面的作用也得到了重視，但是如何保證分離純化蛋白的純度及活性至關(guān)重要[9]。利用蛋白質(zhì)純化及質(zhì)譜鑒定技術(shù)筆者得到了具有生物活性的丹參凝集素蛋白(SMLP)，并研究了其對大鼠VSMCs增殖的影響，以及利用丹參基因組已經(jīng)測序這一優(yōu)勢，獲得丹參凝集素基因，并利用蛋白質(zhì)原核表達(dá)系統(tǒng)在體外表達(dá)純化有功能的SMLP，為進(jìn)一步研究丹參凝集素的功能、其促進(jìn)VSMCs增殖的機(jī)制及在其他領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 中藥丹參購自藥店，并經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院鑒定。大鼠VSMCs A7r5購自上海慧穎生物科技有限公司，抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)公司。分子克隆相關(guān)試劑：DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶購自日本TaKaRa公司，感受態(tài)細(xì)胞Trans I-TI、BL21購自全式金生物技術(shù)公司。蛋白表達(dá)相關(guān)試劑：LB培養(yǎng)基、卡那霉素、誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)購自上海生工。蛋白純化相關(guān)試劑：鎳柱(Ni NTA beads)、陰離子交換柱及分子篩購自美國GE公司。

1.2方法

1.2.1丹參蛋白的提取分離 丹參藥材經(jīng)粉碎后，按照1∶5(g/mL)加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，4 ℃浸泡24 h后，4 ℃，5 000×g離心10 min后將上清液轉(zhuǎn)移到濃縮管，濃縮后，經(jīng)分子篩superdex 200分離，并利用陰離子交換柱進(jìn)一步分離得到目的蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測分離純化后的蛋白，并用于后續(xù)的質(zhì)譜鑒定。

1.2.2噻唑藍(lán)(MTT)實驗 以3 000個/孔的細(xì)胞密度將A7r5細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞貼壁。實驗組每孔加入不同濃度的丹參凝集素蛋白，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加10 μL的MTT(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩5 min，使MTT結(jié)晶完全溶解，以空白對照孔調(diào)零，酶聯(lián)免疫檢測分析儀測定490 mm處的吸光度值(A值)，各復(fù)孔A值的平均值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)，所檢測的A值的大小可反映活細(xì)胞數(shù)量。MTT實驗至少重復(fù)3次。

1.2.3免疫印跡法(Western blot) 對照組和SMLP處理組細(xì)胞用RAPA裂解液裂解后，二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度，利用SDS-PAGE分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%奶粉封閉1 h后，加入一抗4 ℃孵育過夜，Tris緩沖鹽-吐溫溶液(TBST)洗膜后，二抗孵育2 h，顯色。

1.2.4pet-28a-sml原核表達(dá)載體構(gòu)建 以丹參為材料，抽提其葉片總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)的方法得到其cDNA第一鏈。以cDNA為模板，通過PCR的方法體外擴(kuò)增出丹參凝集素基因sml，通過NheI和XhoI限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶將sml基因插入到原核表達(dá)載體pet-28a，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提質(zhì)粒送武漢擎科生物公司測序，確認(rèn)序列正確，引物合成及質(zhì)粒測序由武漢擎科生物公司完成。所用上下游引物中正向：5′-CTA GCT AGC ATG GCC AAC CTT CCC CAA AC-3′；反向：5′- CCG CTC GAG TCA AAT CTG CTT AAG GCT GAC-3′。

1.2.5蛋白表達(dá)及純化 取測序正確的pet-28a-sml質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)蛋白的感受態(tài)細(xì)胞BL21，將菌接種到LB培養(yǎng)基，并加入卡那霉素(50 μg/mL)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至A值達(dá)到0.8，加入終濃度為0.5 mmol/L的誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，24 ℃誘導(dǎo)12 h后，5 000 r/min離心15 min收集菌體，超聲破碎后12 000×g離心30 min，收集上清液與鎳柱結(jié)合，Wash buffer(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，200 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑)洗掉非特異結(jié)合的蛋白，Elution buffer(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，200 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑)將凝集素蛋白從鎳柱上洗脫下來，經(jīng)離子交換柱進(jìn)一步純化后，濃縮到5 mg/mL，并過濾除菌，用于后續(xù)細(xì)胞實驗或冷凍于-80 ℃保存。

1.2.6紅細(xì)胞凝集實驗 制備2%小鼠紅細(xì)胞懸液，吸取少許滴兩滴到干凈的玻片上，分別加入PBS和0.6 μmol/L SMLP，2 min后觀察紅細(xì)胞凝集的結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1丹參活性蛋白的分離 將中藥丹參粉碎后，用PBS浸提丹參蛋白后，將總蛋白經(jīng)過分子篩分離，得到3個主要的組分P1、P2和P3。將這3個組分經(jīng)SDS-PAGE分離后，得到了一個相對分子質(zhì)量25×103左右，并且含量較多的蛋白，見圖1A。為進(jìn)一步純化該蛋白，將P1組分繼續(xù)通過陰離子交換柱，得到了純化的丹參蛋白，見圖1B。

A：分子篩分離丹參蛋白電泳分析；B：陰離子交換柱分離蛋白電泳分析

圖1 丹參蛋白的分離純化及電泳分析

2.2丹參活性蛋白的鑒定 采用質(zhì)譜鑒定純化的丹參活性蛋白，并與丹參基因組數(shù)據(jù)庫比對得到該蛋白的氨基酸序列，見圖2A。使用美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫的Blast功能進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對，得出該蛋白是一種L型的植物凝集素，將該蛋白稱為SMLP。

2.3SMLP素促進(jìn)VSMCs增殖 為檢測SMLP對VSMCs的增殖作用，將從丹參中分離純化的SMLP加入到A7r5細(xì)胞培養(yǎng)液中，處理24 h后，利用MTT實驗檢測細(xì)胞的增殖率。結(jié)果表明，SMLP能夠明顯促進(jìn)VSMCs的增殖，見圖3A。為進(jìn)一步確認(rèn)SMLP對A7r5細(xì)胞的促增殖作用，利用Western blot檢測增殖相關(guān)基因蛋白激酶B(AKT)基因與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)總蛋白表達(dá)水平，以及二者的磷酸化水平，見圖3B；同時，檢測凋亡相關(guān)基因JNK1和Bax，見圖3C。結(jié)果表明，SMLP能夠促進(jìn)ATK及mTOR的磷酸化，磷酸化AKT(p-AKT)和磷酸化mTOR(p-mTOR)水平升高，總ATK及mTOR未發(fā)生明顯變化，而相關(guān)凋亡基因的表達(dá)水平被抑制。

A：丹參活性蛋白的氨基酸序列；B：蛋白質(zhì)序列比對

圖2 丹參活性蛋白質(zhì)譜鑒定

A：MTT實驗檢測SMLP對A7r5細(xì)胞的增殖作用；B：不同濃度SMLP處理細(xì)胞后AKT、mTOR及其磷酸化水平；不同濃度SMLP處理細(xì)胞后凋亡相關(guān)基因JNK1和Bax的變化水平；*：P<0.05，#：P<0.01

圖3 SMLP促進(jìn)VSMCs增殖

A：PCR擴(kuò)增丹參凝集素基因sml；B：雙酶切驗證sml基因插入到原核表達(dá)載體pet-28a；泳道1：未經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒；泳道2：酶切之后的重組質(zhì)粒；C：體外表達(dá)純化SMLP；M：蛋白標(biāo)志物

圖4 SMLP的原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化

2.4SMLP的原核載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化 丹參是首個基因組測序的中草藥，利用這一優(yōu)勢，構(gòu)建了丹參凝集素基因的原核表達(dá)載體。通過PCR的方法體外擴(kuò)增出丹參凝集素基因sml，見圖4A；通過酶切連接的方法將sml基因插入到原核表達(dá)載體pet28a，經(jīng)雙酶切驗證，成功構(gòu)建了pet28a-sml載體，見圖4B；經(jīng)測序確認(rèn)序列正確后，將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21，誘導(dǎo)表達(dá)帶有His標(biāo)簽的SMLP，純化后得到了高純度的SMLP，見圖4C。

2.5SMLP活性檢測 為分析體外表達(dá)純化的丹參凝集素蛋白是否具有功能，檢測其凝集紅細(xì)胞的功能。結(jié)果顯示，左側(cè)紅細(xì)胞懸液加入PBS，紅細(xì)胞均勻分散，并無凝集；右側(cè)紅細(xì)胞懸液加入純化的凝集素蛋白SMLP，紅細(xì)胞凝集成塊，顏色加深，見圖5。

圖5 SMLP血細(xì)胞凝集實驗

3 討 論

目前，中草藥小分子化合物的分離鑒定取得了很大的進(jìn)展，多種小分子被應(yīng)用于抗腫瘤及心血管疾病的治療，包括生物堿類、甙類、酮類、萜類和揮發(fā)油類等[10]。但是，中草藥中除了這些重要的次生代謝產(chǎn)物外，還存在很多活性蛋白，它們的重要性往往被忽視。主要原因是從中草藥中提純蛋白質(zhì)有一定的難度。如何在提取過程中保證蛋白質(zhì)的純度及活性非常關(guān)鍵。并且，由于大多數(shù)中草藥基因組尚未測序，很難得到確切的蛋白序列并了解其功能，也很難利用一些基因工程技術(shù)手段大量地表達(dá)這些蛋白，影響了其應(yīng)用價值。

丹參作為常用的活血化瘀藥物，在治療心血管疾病方面具有重要的作用。丹參含有多種化學(xué)成分，具有多種藥理活性。目前，從丹參中分離的化學(xué)成分達(dá)100多種，有效成分主要包括脂溶性的丹參酮類和水溶性的酚酸類。多項研究表明，丹參酮類具有改善缺血、抑制心肌肥厚、抗動脈粥樣硬化及抑制血小板聚集等功能。而丹酚酸類則具有活血通絡(luò)的作用，常用于心腦血管疾病的治療[11]。丹參小分子的分離鑒定及藥理作用研究取得了很大的進(jìn)展，但在活性蛋白研究方面仍存在不足。丹參作為第一個基因組測序的中草藥，研究其活性蛋白有很大的優(yōu)勢。因此，筆者選擇丹參作為研究對象，分離純化及鑒定其有功能的蛋白。本研究分離并純化得到一個相對分子質(zhì)量約為25×103的蛋白，通過MTT實驗及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，該蛋白能夠明顯促進(jìn)大鼠VSMCs增殖。通過質(zhì)譜鑒定得到其氨基酸序列，經(jīng)蛋白BLAST比對證明，該蛋白是L型的植物凝集素。根據(jù)丹參基因組序列，得到了丹參凝集素基因sml的DNA序列，利用分子克隆及蛋白表達(dá)純化技術(shù)，得到大量高純度的SMLP，并利用紅細(xì)胞凝集實驗證明體外表達(dá)純化的SMLP具有紅細(xì)胞凝集的功能。

通過本研究證明，SMLP能夠促進(jìn)大鼠VSMCs增殖，其可能通過激活PI3K-AKT-mTOR信號通路。VSMCs的增殖受多種生長刺激因子和抑制因子的雙重調(diào)節(jié)。它們通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與VSMCs的増殖及凋亡，其中PI3K-AKT信號通路被證明是非常重要的一條通路[12-14]。AKT蛋白在各種組織中廣泛表達(dá)，如在心臟、肝臟、腎臟和骨骼肌等組織中表達(dá)，主要通過上游的PI3K磷酸化被激活，并調(diào)節(jié)下游的多個靶基因，如mTOR、核因子-κB(NF-κB)、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)和FKHR等，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、調(diào)亡及遷移等[15]。本研究結(jié)果表明，SMLP能夠促進(jìn)VSMCs AKT和mTOR蛋白的磷酸化，并且能夠抑制相關(guān)凋亡蛋白水平，從而促進(jìn)其增殖。但SMLP能否促進(jìn)其他細(xì)胞的增殖，以及是否還會通過其他信號通路，仍需進(jìn)一步研究。

VSMCs是唯一能通過遷移、增殖和合成細(xì)胞外基質(zhì)來修復(fù)受損血管壁的血管細(xì)胞，是構(gòu)成血管中膜并執(zhí)行相應(yīng)生理功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有保持血管完整性和維持血管張力的作用。SMLP能夠促進(jìn)其增殖，這對于VSMCs發(fā)揮正常生理功能具有重要意義。但在病理過程中，VSMCs功能障礙與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。VSMCs通過自身增殖、遷移及合成細(xì)胞外基質(zhì)參與高血壓、動脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等多種血管疾病的病理過程[16-18]。因此，闡明VSMCs增殖的調(diào)節(jié)機(jī)制，對于理解心血管疾病的發(fā)病過程及臨床治療非常關(guān)鍵。本研究初步發(fā)現(xiàn)SMLP能夠促進(jìn)VSMCs增殖，下一步通過體外蛋白質(zhì)相互作用方法pull-down等，可以找到與SMLP相互作用的細(xì)胞表面受體，以及其激活的增殖相關(guān)的信號通路，將進(jìn)一步揭示VSMCs增殖的機(jī)制，對于理解心血管疾病的發(fā)病機(jī)制有重要意義。除此之外，植物凝集素具有多種重要的功能，如凝集紅細(xì)胞、參與植物的防御反應(yīng)及促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分裂等，而且植物凝集素被廣泛地應(yīng)用于靶向性藥物載體[19-20]。目前多種植物凝集素被分離鑒定，但是只能利用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離辦法，其純度及活性都很難得到保證。丹參的全基因組已經(jīng)測序，這對于研究其功能蛋白就簡單了很多，利用基因工程技術(shù)，可以很容易地獲得高純度并且具有活性的SMLP，這對于后續(xù)研究其功能、藥物開發(fā)及應(yīng)用于多個領(lǐng)域都非常重要。