常占瑛 劉桂花 王梅 古麗巴合爾?卡吾力 布魯根
摘要:目的? 建立新疆石榴皮HPLC指紋圖譜。方法? 采用Agilent SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為甲醇-0.1%三氟乙酸溶液,梯度洗脫,流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長370 nm,進樣量10 μL,測定12批石榴皮樣品,運用相似度分析軟件建立石榴皮指紋圖譜共有模式,并對色譜峰進行指認。結(jié)果? 建立了石榴皮HPLC指紋圖譜,標定了18個共有峰,3個色譜峰得到指認,分別為α-安石榴苷、β-安石榴苷、鞣花酸。結(jié)論? 本研究建立的石榴皮HPLC指紋圖譜方法穩(wěn)定可行,可用于控制石榴皮質(zhì)量。
關(guān)鍵詞:石榴皮;指紋圖譜;高效液相色譜法
中圖分類號:R284.1? ? 文獻標識碼:A? ? 文章編號:1005-5304(2019)04-0074-04
石榴Punica granatum L.為石榴科Punicaceae石榴屬Punica L.落葉灌木或小喬木,別名安石榴[1]。石榴原產(chǎn)于地中海及亞洲西部地區(qū),約公元前2世紀傳入我國。目前,我國栽培石榴主要有六大產(chǎn)區(qū),新疆是我國最西部的石榴產(chǎn)區(qū),種植主要分布在喀什、和田等地。石榴是一種藥食同源的植物資源,其葉、花、汁、籽、果皮、根皆可入藥。研究表明,石榴具有清除自由基、調(diào)節(jié)血脂、預防心腦血管疾病、抗氧化、抗病毒、抗癌及改善婦女圍絕經(jīng)期綜合征等多種生理和藥理活性[2]。石榴皮在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有巨大的
基金項目:新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)民族醫(yī)藥科技人才項目(2016-3-10);新疆維吾爾自治區(qū)高??蒲杏媱濏椖浚╔JEDU2017S021)
通訊作者:高曉黎,E-mail:xli_g@sina.com
應(yīng)用價值[3-5],從1963年起收載入《中華人民共和國藥典》,用于治療久瀉、久痢、便血、脫肛、崩漏、白帶和蟲積腹痛。
石榴皮含有多酚、黃酮、氨基酸、微量元素等多種化學成分。石榴多酚是石榴皮中多酚羥基化合物的總稱,主要存在于石榴果皮中,約為其干質(zhì)量的10.4%~21.3%,主要成分包括安石榴苷、沒食子酸、表兒茶素、石榴皮鞣素等,其中安石榴苷含量最高[4-5]。安石榴苷是目前發(fā)現(xiàn)僅存在于石榴多酚中的特異性成分,也是其主要的單一成分,約占石榴皮總酚含量的65.75%,遠高于鞣花酸和石榴皮鞣素等成分,安石榴苷在體內(nèi)外均具有很強的抗氧化、抗癌、抗菌及抗動脈粥樣硬化等作用[6-7]。本試驗綜合運用相似度評價、主成分分析方法,對石榴皮進行HPLC指紋圖譜研究,為其質(zhì)量控制提供參考。
1? 儀器與試藥
Agilent1220LC型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司),AB135-S型電子天平(瑞士梅特勒公司),HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司),KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,功率200 W,頻率40 kHz)。
安石榴苷對照品(批號MUST-17052603,純度≥98.12)、鞣花酸對照品(批號MUST-18030601,純度≥99.65),成都曼斯特生物科技有限公司;色譜甲醇,三氟乙酸。12批石榴皮樣品(2015年10月采集,S1、S2、S3產(chǎn)地為和田策勒縣,S4、S5、S6產(chǎn)地為和田皮山縣,S7、S8、S9產(chǎn)地為喀什市,S10、S11、S12產(chǎn)地為喀什葉城縣)經(jīng)新疆醫(yī)科大學藥學院帕麗達·阿不力孜教授鑒定,均為石榴科植物石榴Punica granatum L.的成熟干燥果皮。
2? 方法與結(jié)果
2.1? 色譜條件
色譜柱為Agilent SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為0.1%三氟乙酸-甲醇,梯度洗脫(0~10 min,5%甲醇;10~25 min,20%甲醇;25~35 min,45%甲醇;35~45 min,65%甲醇),檢測波長370 nm,流速1 mL/min,進樣量10 μL,柱溫30 ℃。
2.2? 對照品溶液的制備
精密稱取適量安石榴苷、鞣花酸對照品,置棕色容量瓶中,甲醇溶解并定容、搖勻,制成每1 mL各含75 ?g的溶液,即得。
2.3? 供試品溶液的制備
精密稱定25 mg石榴皮,置容量瓶中,精密加入25 mL甲醇,稱定質(zhì)量,超聲處理20 min,放室溫至冷,再次稱定質(zhì)量,用甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻混合,精密吸取5 mL至10 mL容量瓶中,甲醇定容至刻度,搖勻混合,過0.22 μm微孔有機濾膜,即得。
2.4? 樣品測定
精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL,按“2.1”項下條件進樣,記錄45 min色譜圖。
2.5? 方法學考察
2.5.1? 精密度試驗
取“2.3”項下供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,測得各色譜峰相對保留時間RSD均小于0.26%,相對峰面積RSD均小于3.0%,表明儀器精密度良好。
2.5.2? 穩(wěn)定性試驗
取“2.3”項下供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件,分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣,測得各色譜峰相對保留時間RSD均小于0.30%,相對峰面積RSD均小于3.0%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.5.3? 重復性試驗
按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項下條件分析,測得各色譜峰相對保留時間RSD均小于0.5%,相對峰面積RSD均小于3.0%,表明該方法重復性良好。
2.6? 指紋圖譜的建立
2.6.1? 參照峰選擇
石榴皮中鞣花酸色譜峰(18號峰)峰形相對比較對稱,且含量穩(wěn)定,故將鞣花酸色譜峰定為石榴皮HPLC指紋圖譜的參照峰。
2.6.2? 共有峰標定及化學成分指認
取12批石榴皮樣品,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,進樣測定,選擇較穩(wěn)定的色譜峰,結(jié)果共標定了18個色譜峰為石榴皮HPLC指紋圖譜的共有指紋峰(見圖1、圖2)。12批石榴皮樣品指紋圖譜見圖3。采用面積歸一化法計算,18個共有峰的峰面積之和占總峰面積的90%以上,根據(jù)保留時間,指認4號峰為α-安石榴苷,5號峰為β-安石榴苷,18號峰為鞣花酸。以鞣花酸色譜峰作為參照峰,計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果相對峰面積的RSD為0~2.97%,相對保留時間的RSD為0~0.73%,具有非常強的一致性,符合指紋圖譜的技術(shù)要求(RSD<3%),見表1、表2。
2.6.3? 相似度分析
將12批石榴皮HPLC指紋圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)》軟件中,對其相似度進行分析。12批石榴皮指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致,指紋特征峰的相對保留時間基本一致,表明四產(chǎn)地的樣品差異不大。相似度計算結(jié)果(見表3)表明,不同產(chǎn)地石榴皮化學成分的組成基本一致。石榴皮指紋圖譜中共標定了18個共有峰,整個色譜圖可分為3個區(qū)域:第一指紋特征區(qū)的保留時間段約在0~22 min處,該區(qū)特征指紋峰較多,共6個,其中4號峰為α-安石榴苷,5號峰為β-安石榴苷,且二者相對含量較大,是整個指紋圖譜中較為重要的2個峰;第二指紋特征區(qū)的保留時間段約在22~28 min處,該區(qū)共有5個特征指紋峰,峰形較好且含量相對較小;第三指紋特征區(qū)的保留時間段約在28~40 min處,該區(qū)共有7個特征指紋峰,18號峰為鞣花酸色譜峰,因其含量較高、峰形較好、基本對稱,故以其作為石榴皮HPLC指紋圖譜的參照峰。
3? 討論
研究中藥指紋圖譜主要有化學方法和生物方法兩類?;瘜W方法包括HPLC、質(zhì)譜指紋圖譜法、紅外光譜指紋圖譜法、紫外分光光度法及高效毛細管電泳指紋圖譜法;生物方法包括DNA法和生物色譜法。其中以HPLC最為常用,具有較高分離效能、分析速度快、檢測靈敏性好、選擇性強、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。本試驗建立的石榴皮HPLC指紋圖譜信息量大、操作簡便、外界因素影響可控,具有較高的色譜重現(xiàn)性且穩(wěn)定性良好,可用于石榴皮的質(zhì)量評價。
在流動相的選擇上,本試驗嘗試了甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.5%磷酸、甲醇-乙腈-0.2%三氟乙酸[8]、乙腈-0.1%三氟乙酸、甲醇-0.1%三氟乙酸等溶劑系統(tǒng)作為流動相,結(jié)果以乙腈-0.1%三氟乙酸與甲醇-0.1%三氟乙酸作為流動相的分離效果、峰型均相差不大,因此,選擇采用甲醇-0.1%三氟乙酸作為流動相進行梯度洗脫。
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(收稿日期:2018-05-31)
(修回日期:2018-07-12;編輯:陳靜)