汪白云 楊柳 劉國良 樸成玉 李慶偉 薛慧 劉斌

[摘要] 目的 基于代謝靶標(biāo)角度揭示補(bǔ)陽還五湯對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法 選取20只7月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象，建立阿爾茨海默病模型。將APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為2組，即模型組和補(bǔ)陽還五湯組（9.26 g/kg）;另選取10只健康的BALB/c小鼠作為空白組。補(bǔ)陽還五湯組灌胃給予補(bǔ)陽還五湯，空白組及模型組給予生理鹽水。連續(xù)灌胃35 d后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，測定小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。在此基礎(chǔ)上，采用高通量液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對各組小鼠尿液進(jìn)行全面分析，通過終端代謝產(chǎn)物回溯疾病發(fā)展過程中的關(guān)鍵代謝酶或代謝通路，聚焦APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)病機(jī)制以及補(bǔ)陽還五湯的作用機(jī)制。 結(jié)果 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，與空白組比較，模型組穿越平臺次數(shù)明顯減少（P < 0.01），補(bǔ)陽還五湯組穿越平臺的次數(shù)顯著增加（P < 0.01）、在目標(biāo)象限的停留時(shí)間顯著增加（P < 0.01）?？臻g定位航行實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)陽還五湯組較模型組的逃避潛伏期明顯縮短（P < 0.01）。通過進(jìn)一步尿液代謝軌跡分析發(fā)現(xiàn)，各組小鼠尿液聚類良好，空白組和模型組間分離明顯，補(bǔ)陽還五湯組則處于兩組間。通過分組貢獻(xiàn)較大的差異離子分析發(fā)現(xiàn)其主要分布在鞘脂代謝和脂肪酸代謝。給予補(bǔ)陽還五湯后上述代謝通路明顯呈回調(diào)趨勢。經(jīng)高分辨質(zhì)譜鑒定獲取了4個(gè)代謝異常的生物標(biāo)志物，分別是花生四烯酸、神經(jīng)胺、L-棕櫚酰肉毒堿、甘油磷脂酰膽堿。通過組學(xué)數(shù)據(jù)處理平臺Metaboanalyst 4.0的在線分析可知其主要涉及兩種代謝通路，分別是鞘脂代謝和花生四烯酸代謝。 結(jié)論 補(bǔ)陽還五湯對阿爾茨海默病小鼠作用明顯，可有效改善其學(xué)習(xí)記憶能為。調(diào)節(jié)氨基酸代謝及能量轉(zhuǎn)化可能是其調(diào)節(jié)阿爾茨海默病的關(guān)鍵機(jī)制。

[關(guān)鍵詞] 補(bǔ)陽還五湯;阿爾茨海默病;代謝組學(xué);通路;機(jī)制

[中圖分類號] R289.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（b）-0013-05

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease）是臨床上常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理特征為β-淀粉樣蛋白沉積所形成的老年斑及神經(jīng)元丟失，近年來其發(fā)病率逐漸升高[1]。此外，阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，且臨床上確證有效的藥物極少，因此阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制和有效藥物亟待進(jìn)一步深入研究[2]。近年來轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動物逐漸成為研究阿爾茨海默病的焦點(diǎn)，其具備自發(fā)性代謝調(diào)控致阿爾茨海默病的特點(diǎn)，且病理機(jī)制和行為特征與阿爾茨海默病患者極為相似，是公認(rèn)的現(xiàn)階段研究阿爾茨海默病的最佳動物模型。但由于其價(jià)格過高，因此其應(yīng)用范圍存在一定的局限性。本研究選取APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象，并基于高通量的尿液代謝組學(xué)技術(shù)獲取轉(zhuǎn)基因小鼠的代謝數(shù)據(jù)，為阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制研究提供依據(jù)。

補(bǔ)陽還五湯出自清代王清任所著《醫(yī)林改錯》，具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)之功效。大量研究[3-10]表明，補(bǔ)陽還五湯能顯著降低大鼠β-淀粉樣蛋白含量，改善腦部血液流變量，緩解動脈粥樣硬化。本研究在評價(jià)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠空間探索能力和定位能力的基礎(chǔ)上，采用代謝組學(xué)技術(shù)從代謝徑路水平探究其發(fā)病機(jī)制，以期為補(bǔ)陽還五湯干預(yù)作用的藥效機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 主要儀器? Q-ExactiveTM（美國Thermo Fisher Scientific公司）;ML-T分析天平（瑞士梅特勒托利多）;VDUPL超純水機(jī)（九方沃德科技有限公司）;Morri水迷宮（安徽淮北正華生物儀器有限公司）。

1.1.2 主要試藥? 生黃芪（批號：131109）、當(dāng)歸尾（批號：131001）、赤芍（批號：121003）、川芎（批號：20140501）、地龍（批號：121002）、桃仁（批號：20140401）、紅花（批號：130901），經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)學(xué)院周忠光教授鑒定均為正品。補(bǔ)陽還五湯水煎液由田明教授制備，水煎液經(jīng)冷凍干燥制備成干粉（出粉率是34.11%，1 g干粉相當(dāng)于生藥量2.93 g），并保存于干燥器中，備用。

1.1.3 補(bǔ)陽還五湯處方組成? 生黃芪120 g、當(dāng)歸尾6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、地龍3 g、桃仁3 g、紅花3 g。

1.2 動物

選取雄性7月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠20只，體重（40±10）g，建立阿爾茨海默病小鼠模型;雄性7月齡清潔級BALB/c小鼠10只，體質(zhì)量（30±10）g。實(shí)驗(yàn)動物由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號：NO.211002300013 027。實(shí)驗(yàn)開始前，小鼠在動物室中適應(yīng)7 d，并采用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室水及食物喂養(yǎng)，動物室保持在22～26℃，相對濕度（50±5）%，暗/光循環(huán)12/12 h。

1.3 動物分組及代謝樣本制備

20只APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠根據(jù)體重?cái)?shù)值按隨機(jī)數(shù)列方法分為2組，即模型組和補(bǔ)陽還五湯組，每組10只。另選10只BALB/c小鼠作為空白組?？瞻捉M和模型組每天自由飲食和飲水，補(bǔ)陽還五湯組連續(xù)35 d灌胃給予9.26 g/kg的補(bǔ)陽還五湯[9]。實(shí)驗(yàn)第35天收集夜尿12 h，于4℃下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心20 min，取尿液上清液，置于EP管中，于-80℃下保存;代謝組學(xué)分析樣本取原尿液，在上述條件下離心后，采用0.22 μm微孔濾膜濾過，以續(xù)濾液作為代謝物分析供試品溶液。

1.4 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠Morris水迷宮測試

末次給藥后連續(xù)4 d給予相關(guān)訓(xùn)練，其后APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行空間學(xué)習(xí)能力測試，具體分為兩部分測試：首先進(jìn)行空間定位航行實(shí)驗(yàn)，所有組小鼠均測試3次，取均值。將Morris水迷宮均分為4個(gè)象限，每個(gè)象限的坐標(biāo)貼上標(biāo)識。將APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠沿象限標(biāo)識放入水中，并開始計(jì)時(shí)，直至小鼠爬上水中平臺，記錄逃避潛伏期時(shí)間。然后進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，撤去水下平臺，將小鼠在相同如水地點(diǎn)放入水中，記錄小鼠進(jìn)入放置平臺的所在象限消耗時(shí)間和進(jìn)入該象限的次數(shù)。

1.5 代謝組學(xué)分析條件

色譜柱：Hypersil ODS C18（30 mm×4.6 mm，3 μm）（美國Thermo Fisher Scientific公司）;乙腈溶液作為流動相A，0.1%甲酸-水溶液作為流動相B;柱溫31℃;流速為0.4 mL/min;進(jìn)樣量為4 μL;梯度洗脫方法見表1。

電噴霧離子源：采用Q-ExactiveTM質(zhì)譜分析系統(tǒng)（高分辨四級桿串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜儀）;脫溶劑氣流量：800 L/h;脫溶劑氣溫度：300℃;錐孔反吹氣流量：60 L/h;離子源溫度：150℃;錐孔電壓：35 V;毛細(xì)管電壓：3.0 kV。

1.6 數(shù)據(jù)處理

代謝數(shù)據(jù)采用熱電公司XCMS-Online分析軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，然后采用SIMCA 11.5（瑞典Umetrics公司）軟件對代謝矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，通過降維處理篩選組間差異貢獻(xiàn)大的離子作為潛在生物標(biāo)記物，結(jié)合VIP大于1和HMDB中收錄的代謝物進(jìn)行比對。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

2.1.1 三組小鼠定位航行能力? 小鼠定位航行能力采用逃避潛伏期進(jìn)行表示。隨著訓(xùn)練時(shí)的延長，各組小鼠的逃避潛伏期縮短，小鼠的學(xué)習(xí)能力提高。補(bǔ)陽還五湯組小鼠第4天的逃避潛伏期較模型組同期低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。與空白組比較，模型組小鼠的逃避潛伏期明顯増加（P < 0.05或P < 0.01），提示模型小鼠出現(xiàn)顯著學(xué)習(xí)障礙。與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組小鼠逃避潛伏期顯著下降約45.85%，提示補(bǔ)陽還五湯能夠在一定程度上改善AD小鼠學(xué)習(xí)能力。見表2。

2.1.2 三組小鼠空間探索能力? 阿爾茨海默病小鼠的空間探索能力用穿越平臺次數(shù)和靶象限停留時(shí)間表示。與空白組比較，模型組小鼠的穿越平臺次數(shù)和靶象限停留時(shí)間明顯減少（P < 0.01），提示模型組小鼠存在學(xué)習(xí)記憶障礙。與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組平臺穿越次數(shù)和靶象限停留時(shí)間明顯增加（P < 0.01），提示補(bǔ)陽還五湯能夠一定程度地改善阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。見表2。

2.2 代謝組學(xué)研究

本部分基于高分辨質(zhì)譜技術(shù)對阿爾茨海默病小鼠模型尿液進(jìn)行信息采集，進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。最終帶入Simcap 11.5進(jìn)行模式識別分析?？瞻捉M和模型組兩組組內(nèi)代謝聚集明顯，組間分離顯著，補(bǔ)陽還五湯組則處于兩組間，補(bǔ)陽還五湯組部分分布與空白組重合，提示補(bǔ)陽還五湯組整體代謝向健康狀態(tài)發(fā)展，補(bǔ)陽還五湯對阿爾茨海默病小鼠有良好的干預(yù)作用。通過OPLS-DA篩選生物標(biāo)記物。結(jié)合數(shù)據(jù)庫共鑒定出潛在生物標(biāo)記物4個(gè)（如表4），代謝通路富集分析，神經(jīng)胺鑒定過程以神經(jīng)胺為例。

4 討論

花生四烯酸代謝是炎性反應(yīng)代謝的重要組成部分。其在炎炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。本研究監(jiān)測到花生四烯酸代謝途徑中花生四烯酸水平都有所升高。在氧化應(yīng)激作用下，存在磷脂酶A2（sPLA2）的激活，激活的sPLA：通過增強(qiáng)蛋白激酶C（PKC）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）的活性，進(jìn)而增加胞質(zhì)型磷脂酶A2（cPLA2）的激活，促進(jìn)花生四烯酸釋放。它們水平的升高加重了氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而加劇阿爾茨海默病的發(fā)展。

神經(jīng)鞘脂類成分是構(gòu)成神經(jīng)組織的主要脂類。是胚胎發(fā)育階段神經(jīng)系統(tǒng)和血管系統(tǒng)形成的重要原料，具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用[11-14]。本研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病小鼠血液中神經(jīng)胺含量降低，可能與阿爾茨海默病發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞膜破裂是阿爾茨海默病最顯著的特性退化之一，與膜脂質(zhì)代謝異常有關(guān)。阿爾茨海默病患者腦內(nèi)存在豐富的被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，其作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫細(xì)胞，激活可產(chǎn)生補(bǔ)體蛋白、炎癥因子等神經(jīng)毒性物質(zhì)，從而激活免疫炎性反應(yīng)產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

脂肪酸細(xì)胞結(jié)構(gòu)、能源存儲和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物活性分子，神經(jīng)元中占有非常高的水平（50%的神經(jīng)元細(xì)胞膜是由多不飽和脂肪酸構(gòu)成）。有研究[15-20]表明，高水平的自由脂肪酸導(dǎo)致大鼠β-淀粉樣蛋白沉積和tau蛋白過度磷酸化，與阿爾茨海默病病程緊密相關(guān)。

本研究采用目前公認(rèn)的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為阿爾茨海默病最佳動物模型，并基于高通量代謝組學(xué)技術(shù)對健康、疾病及給藥的不同狀態(tài)下小鼠尿液進(jìn)行分析;通過模式識別和比對多元質(zhì)譜庫信息進(jìn)行代謝物的鑒定，最終獲得與阿爾茨海默病密切相關(guān)的生物學(xué)信息。給予補(bǔ)陽還五湯后，這些通路得到一定程度的抑制，推斷得到的生物標(biāo)志物代謝是補(bǔ)陽還五湯治療阿爾茨海默病的潛在作用靶點(diǎn)。借助代謝組學(xué)技術(shù)，對補(bǔ)陽還五湯防治阿爾茨海默病的轉(zhuǎn)基因小鼠血漿代謝組進(jìn)行輪廓表征和模式識別分析，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯的早期干預(yù)能明顯影響阿爾茨海默病模型大鼠的代謝網(wǎng)絡(luò)，初步判定了4個(gè)阿爾茨海默病生物標(biāo)記物;通過追蹤關(guān)鍵代謝產(chǎn)物相關(guān)聯(lián)的代謝通路的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯影響的主要代謝經(jīng)路包括脂類代謝、脂肪酸代謝等。

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（收稿日期：2018-10-06? 本文編輯：王? ?蕾）