王磊 翁小東 陳志遠(yuǎn) 劉修恒

[摘要] 目的 探討青蒿虎酯對大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后缺血再灌注損傷的影響。 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將18只成年健康雄性SD大鼠分為對照組、缺血組和青蒿虎酯組，每組6只，建立睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位動物模型（720°維持2 h）。青蒿虎酯組于術(shù)前3 d灌胃青蒿琥酯25 mg/（kg·d），對照組和缺血組灌胃同體積蒸餾水。復(fù)位后4 h處死大鼠并獲取睪丸組織，分別檢測組織丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）含量，采用HE染色和TUNEL染色檢測組織病理學(xué)參數(shù)和生精細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）。Western blot檢測各組睪丸組織多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）-1和凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）的表達(dá)。 結(jié)果 與對照組比較，缺血組和青蒿虎酯組SOD活性和曲細(xì)精管直徑明顯降低，而MDA含量、凋亡指數(shù)、PARP-1和AIF表達(dá)則顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;與缺血組比較，青蒿虎酯組SOD活性和曲細(xì)精管直徑顯著升高，MDA含量、凋亡指數(shù)、PARP-1和AIF表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 青蒿虎酯對睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后的缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

[關(guān)鍵詞] 青蒿虎酯;睪丸;扭轉(zhuǎn);缺血

[中圖分類號] R697.22? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（b）-0018-04

睪丸扭轉(zhuǎn)是泌尿外科的常見急癥之一，多發(fā)生于青少年[1]。發(fā)生扭轉(zhuǎn)的睪丸必須在6 h內(nèi)復(fù)位恢復(fù)血供，否則發(fā)生扭轉(zhuǎn)的睪丸生精細(xì)胞會發(fā)生不可逆性的細(xì)胞損傷[2-3]。手術(shù)復(fù)位及時(shí)的患者，術(shù)后仍有可能出現(xiàn)扭轉(zhuǎn)側(cè)睪丸的生精功能下降，有的患者還會出現(xiàn)扭轉(zhuǎn)側(cè)睪丸萎縮、精子活力下降、數(shù)量減少等[4]，其機(jī)制與扭轉(zhuǎn)側(cè)睪丸復(fù)位后的缺血再灌注損傷密切相關(guān)[5]。青蒿琥酯是具有β-倍半帖內(nèi)酯類青蒿素的衍生物，具有抗瘧、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能等多種藥理作用[6-8]。近年來研究表明青蒿琥酯還具有減輕腎臟缺血再灌注損傷的作用，但對于睪丸缺血再灌注損傷是否有保護(hù)作用，目前報(bào)道較少。本研究旨在觀察青蒿琥酯對睪丸缺血再灌注后的睪丸細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性SD大鼠18只（250～300 g），8～10周齡，SPF級，購自于武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心（合格證號：42009800001176），造模前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，室溫19～23℃室內(nèi)飼養(yǎng)，相對濕度60%，每日12 h光照，自由飲水、進(jìn)食。動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 試劑

青蒿琥酯：廣西桂林南藥股份有限公司（純度 >99%，批號：ZA080203）;多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）-1（sc-53643）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）（sc-55519）抗體購于santacruz公司;BCA蛋白濃度試劑盒（P0012）購于碧云天生物技術(shù)研究所;超氧化物歧化酶（SOD）（A001-3）、丙二醛（MDA）（A003-1）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 模型的建立與分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)大鼠分為對照組、缺血組和青蒿虎酯組，每組6只。各組大鼠麻醉成功后取下腹切口，游離左側(cè)睪丸并切斷睪丸引帶，分離至附睪頭。對照組：將睪丸順時(shí)針扭轉(zhuǎn)720°后立即復(fù)位固定，關(guān)閉切口。缺血組和青蒿琥酯組：順時(shí)針扭轉(zhuǎn)720°并維持2 h，其間夾閉切口，后將睪丸復(fù)位固定，睪丸由暗紅色變鮮紅色代表造模成功。術(shù)前3 d灌胃青蒿琥酯25 mg/（kg·d），單次給藥。對照組和缺血組灌胃同體積蒸餾水。

1.4 樣本采集和處理

1.4.1 標(biāo)本采集? 各組大鼠復(fù)位4 h后處死，獲取的睪丸組織一部分置于液氮中保存，另一部分用固定液固定，常規(guī)石蠟包埋后檢測組織病理學(xué)改變和生精細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.4.2 SOD活力和MDA含量檢測? 獲取各組大鼠睪丸組織后，取50 mg組織，加入0.9 mL生理鹽水制成10%的組織勻漿。采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，鄰苯三酚法測定SOD活性，具體操作步驟按照南京建成生物工程研究所的操作步驟進(jìn)行檢測[9]。

1.4.3 組織病理學(xué)檢查? 造模成功后，取各組大鼠的睪丸組織，用多聚甲醛固定后，依次脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟，行HE染色后，在200×光鏡下觀察其病理改變。通過檢測曲細(xì)精管直徑和生精細(xì)胞層數(shù)評價(jià)睪丸生精功能。曲細(xì)精管直徑通過顯微測微器檢測;生精細(xì)胞層數(shù)通過90°、180°、270°和360° 4個(gè)方向計(jì)數(shù)生精細(xì)胞層數(shù)后得出平均值。

1.4.4 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡? TUNEL染色后光鏡下觀察，胞核呈棕黃色者為凋亡陽性細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)視野，在200×光鏡下計(jì)數(shù)凋亡陽性細(xì)胞，凋亡指數(shù)為凋亡陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.4.5 Western blot檢測PARP-1、AIF的表達(dá)? 從-80℃冰箱中取出保存后的睪丸組織，BCA試劑盒計(jì)算各組蛋白濃度，取40 μg蛋白上樣，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，后加入1∶1000稀釋的PARP-1、AIF抗體，4℃下孵育過夜。之后與相應(yīng)二抗（1∶2000稀釋）結(jié)合，洗膜后ECL法顯色、照相。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠睪丸SOD活性、MDA含量比較

缺血組和青蒿虎酯組睪丸SOD活性顯著低于對照組，而MDA含量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;青蒿虎酯組SOD活性明顯高于缺血組，MDA含量則明顯低于缺血組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.2 各組大鼠睪丸血清曲細(xì)精管直徑、生精細(xì)胞層數(shù)和凋亡指數(shù)比較

與對照組比較，缺血組和青蒿虎酯組睪丸曲細(xì)精管直徑變小，生精細(xì)胞細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞層數(shù)及數(shù)量減少，生精阻滯，凋亡指數(shù)升高（P < 0.05）。與缺血組比較，青蒿虎酯組睪丸曲細(xì)精管直徑變大，生精細(xì)胞細(xì)胞層數(shù)增多，凋亡指數(shù)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），青蒿虎酯可改善睪丸缺血再灌注所致的曲細(xì)精管和生精上皮細(xì)胞的病理學(xué)損害

2.3 各組大鼠PARP-1、AIF表達(dá)比較

缺血組、青蒿虎酯組PARP-1、AIF表達(dá)明顯高于對照組，青蒿虎酯組PARP-1、AIF表達(dá)顯著低于缺血組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討論

睪丸扭轉(zhuǎn)造成的損傷是不可逆的、最終會導(dǎo)致不育[10]。睪丸扭轉(zhuǎn)后的復(fù)位過程是典型的缺血再灌注損傷過程，期間發(fā)生生精細(xì)胞能量代謝障礙、氧自由基損傷、炎癥遞質(zhì)和基因轉(zhuǎn)錄異常[11]。正常機(jī)體的活細(xì)胞中均可產(chǎn)生氧自由基，而氧自由基的過量釋放會對機(jī)體產(chǎn)生危害。正常情況下機(jī)體存在的抗氧化防御系統(tǒng)可以清除氧自由基及其代謝產(chǎn)物，而當(dāng)氧自由基過量生成時(shí)，體內(nèi)平衡就會被破壞[12-13]。睪丸扭轉(zhuǎn)后抗氧化酶系統(tǒng)遭受損傷，而再灌注過程會產(chǎn)生大量的氧自由基，其通過直接損害或者一系列過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，會引起睪丸細(xì)胞結(jié)構(gòu)的廣泛破壞[11]，因此，清除睪丸內(nèi)的氧自由基對減輕氧化損傷至關(guān)重要。

使用藥物清除活性氧可以作為睪丸外科手術(shù)的有效補(bǔ)充[14-15]。之前的研究結(jié)果已證實(shí)多種抗氧化劑在動物睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位模型中具有減輕缺血再灌注損傷的作用，但是真正能用于臨床的卻并不多[16-18]。青蒿琥酯是具有β-倍半帖內(nèi)酯類青蒿素的衍生物，具有治療瘧疾、病毒、腫瘤以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等藥理作用[19]。本研究沿順時(shí)針方向扭轉(zhuǎn)大鼠左側(cè)睪丸720°，2 h后復(fù)位，建立睪丸缺血再灌注損傷。與對照組比較，缺血組睪丸SOD活性明顯降低，MDA含量顯著升高，而應(yīng)用青蒿虎酯可以升高因缺血降低的SOD水平，降低因扭轉(zhuǎn)缺血升高的MDA含量，提示青蒿虎酯可通過清除氧自由基及增加抗氧化能力而有效改善睪丸扭轉(zhuǎn)造成的生殖細(xì)胞損傷。

本研究利用睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位模型來研究青蒿虎酯對睪丸缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。筆者發(fā)現(xiàn)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位期間的缺血再灌注損傷會造成生精小管明顯萎縮和生精上皮細(xì)胞減少，間質(zhì)明顯水腫及出血。另外，本研究發(fā)現(xiàn)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后可以誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡，與對照組比較，凋亡指數(shù)明顯升高，而青蒿虎酯可以明顯緩解睪丸缺血再灌注后的生精細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，并顯著降低凋亡指數(shù)。在凋亡過程中，PARP-1被切割為兩個(gè)片段，使細(xì)胞內(nèi)的ATP不會被PARP-1的功能活動所耗竭，保證能量供應(yīng)[20]。但是，PARP-1并非被動參與細(xì)胞凋亡過程，其過度激活可促進(jìn)AIF的釋放，引起Caspase途徑依賴的細(xì)胞凋亡過程。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，缺血組和青蒿虎酯組PARP-1和AIF表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。而與缺血組比較，青蒿虎酯組上述指標(biāo)的表達(dá)又顯著下降（P < 0.05）。提示青蒿虎酯預(yù)處理可通過調(diào)節(jié)PARP-1/AIF通路的表達(dá)，從而抑制睪丸細(xì)胞凋亡，這與本研究TUNEL實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果相一致，提示青蒿虎酯預(yù)處理具有保護(hù)睪丸缺血再灌注損傷的作用。

綜上所述，青蒿虎酯對睪丸缺血再灌注后的生精能力具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抑制PARP-1/AIF通路表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，提示青蒿虎酯可作為一種治療睪丸缺血再灌注損傷的有效藥物實(shí)際運(yùn)用于臨床。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Yazawa H，Sasagawa I，Suzuki Y，et al. Glucocorticoid hormone can suppress apoptosis of rat testicular germ cells induced by testicular ischemia [J]. Fertil Steril，2001，75（5）：980-985.

[2]? 趙豫剛，鄭新民，周吉，等.睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后生精上皮細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的改變及其凋亡[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86（20）：1381-1385.

[3]? Kapoor S. Testicular torsion：a race against time [J]. Int J Clin Pract，2008，62（5）：821-827.

[4]? Lysiak JJ，Nguyen QA，Turner TT. Peptide and nonpeptide reactive oxygen scavengers provide partial rescue of the testis after torsion [J]. J Androl，2002，23（3）：400-409.

[5]? Filho DW，Torres MA，Bordin AL，et al. Spermatic cord torsion，reactive oxygen and nitrogen species and ischemia-reperfusion injury [J]. Mol Aspects Med，2004，25（1/2）：199-210.

[6]? Efferth T，Dunstan H，Sauerbrey A，et al. The anti-malarial artesunate is also active against cancer [J]. Int J Oncol，2001，18（4）：767-773.

[7]? 許光蘭，梁勁松，以敏，等.青蒿琥酯對肺纖維化大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長因子β1的影響[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008， 25（3）：400-403.

[8]? 劉文東，李英嫻，婁婷婷，等.青蒿琥酯對肝纖維化大鼠肝組織基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，19（5）：362-364，372.

[9]? 孫倩，曾誠，段薇娜，等.血管緊張素-（1-7）/血管緊張素-Ⅱ通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1通路在糖尿病腎臟缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017，14（20）：12-15，35.

[10]? 胡東來，舒強(qiáng).新生兒睪丸扭轉(zhuǎn)的臨床分析[J].中華泌尿外科雜志，2017，38（2）：118-121.

[11]? Lysiak JJ，Turner SD，Nguyen QA，et al. Essential role of neutrophils in germ cell-specific apoptosis following ischemia/reperfusion injury of the mouse testis [J]. Biol Reprod，2001，65（3）：718-725.

[12]? 張華鋒，趙佳，徐道明.白藜蘆醇對大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)損傷的保護(hù)作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2015，32（6）：1473.

[13]? 郭晶晶，俞麗云，黃美，等.持續(xù)低流量復(fù)灌注對兔睪丸不全扭轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡的影響[J].中國男科學(xué)雜志，2015， 29（1）：22-27.

[14]? 劉子明，鄭新民，李世文，等.大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后的組織結(jié)構(gòu)變化和相關(guān)因素的研究[J].醫(yī)學(xué)新知雜志，2003， 13（1）：17-19.

[15]? 張曉文，李建華，徐赫，等.丹參酮ⅡA對成年大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)的保護(hù)作用和機(jī)制研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2017，36（5）：795-799.

[16]? Payabvash S，Kiumehr S，Tavangar SM，et al. Ethyl pyruvate reduces germ cell-specific apoptosis and oxidative stress in rat model of testicular torsion/detorsion [J]. J Pediatr Surg，2008，43（4）：705-712.

[17]? 徐波，陳海琛，黃國顯，等.褪黑激素對大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)缺血和再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中華小兒外科雜志，2012， 33（7）：532-535.

[18]? 官毅，鄭新民，楊志偉，等.左旋卡尼汀對大鼠睪丸缺血再灌注損傷的防護(hù)作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2009，89（26）：1858-1861.

[19]? 劉桂勇，劉修恒，王磊，等.青蒿琥酯對大鼠腎臟缺血再灌注后纖維化改變的保護(hù)作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2015，32（10）：2485-2487.

[20]? Germain M，Affar EB，D'Amours D，et al. Cleavage of automodified poly（ADP-ribose）polymerase during apoptosis. Evidence for involvement of caspase-7 [J]. J Biol Chem，1999，274（40）：28379-28384.

（收稿日期：2018-07-26? 本文編輯：張瑜杰）