周曉 程志祥

[摘要] 溴結(jié)構域和超末端結(jié)構域（BET）家族屬于溴結(jié)構域蛋白家族，在多種腫瘤中BET家族表達上調(diào)，其與細胞生長、增殖分化、凋亡壞死等多種生物學過程相關，進而參與調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程。BET家族多種抑制劑的Ⅰ期或Ⅱ期臨床實驗正在進行中，相關研究結(jié)果表明，BET抑制劑單藥或聯(lián)合現(xiàn)有藥物在治療多種腫瘤中均有明確的效果，因此，其有望成為腫瘤治療的新靶點。本文通過復習相關文獻對近年來BET家族及其抑制劑在腫瘤研究中的進展進行綜述。

[關鍵詞] 溴結(jié)構域和超末端結(jié)構域;抑制劑;腫瘤;臨床試驗

[中圖分類號] R73? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（b）-0026-05

溴結(jié)構域蛋白（bromodomain proteins，BRDs）是一類進化上高度保守的蛋白，其可識別并結(jié)合組蛋白尾部的乙?；嚢彼釟埢?，招募染色質(zhì)調(diào)節(jié)相關蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重塑因子等，從而在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)重塑中發(fā)揮重要作用，是重要的表觀遺傳“閱讀器”。BRDs一共包含8個亞家族，溴結(jié)構域和超末端結(jié)構域（bromodomain and extra terminal domain，BET）家族是其中研究最多的。人體BET家族由BRD2、BRD3、BRD4、BRDT組成。目前研究表明，BET家族主要通過結(jié)合到組蛋白尾部，發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)細胞生長等作用，與炎癥、癲癇、肥胖、腫瘤等多種生物學過程及疾病發(fā)展有關[1]。本文就近年來BET家族及其抑制劑在腫瘤中的研究進展進行闡述。

1 BET家族的結(jié)構與功能

目前為止，已發(fā)現(xiàn)人體基因組共編碼61種溴結(jié)構域，分布在46種不同的蛋白質(zhì)中。BRDs都含有一個共同的保守折疊結(jié)構，由4個左手α螺旋（αZ、αA、αB、αC）、2個loop環(huán)（ZA環(huán)和BC環(huán)）以及1個可以識別組蛋白ε-N-乙酰化賴氨酸殘基特定序列的疏水腔組成[1]。BET家族由BRD2、BRD3、BRD4、BRDT組成，它們也具有相似的結(jié)構域，即兩個串聯(lián)溴結(jié)構域（BD1、BD2）和一個超末端（ET）結(jié)構域。兩個溴結(jié)構域主要負責識別并結(jié)合乙?；嚢彼釟埢珽T結(jié)構域與輔助因子相互作用，而其具體機制尚不清楚。

雖然BET家族的4個成員具有相似的結(jié)構，但其生物學功能仍存在差異。BRD2有3種亞型（836、801和754個殘基），其參與基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復、細胞增殖、細胞分化等多種生物學過程。BRD2通過與DNA雙鏈斷裂區(qū)（DNA double-strand breaks，DBS）結(jié)合，保護底層乙酰化染色質(zhì)免受組蛋白去乙?；傅墓?，并允許乙?；刂鴤?cè)翼染色質(zhì)擴散，從而促進DNA修復。BRD2在B細胞中對有絲分裂反應基因，尤其是cyclinA起著關鍵的調(diào)控作用[2]。

BRD3僅有一種形式（726個殘基），關于其功能的報道相對較少。最初僅發(fā)現(xiàn)BRD3與乙?；募t系特異性轉(zhuǎn)錄因子（GATA1）位點結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄，參與造血過程的調(diào)控。近年來，有少數(shù)關于BRD3在炎性反應及腫瘤中的報道。BRD3可以通過提高IL-6啟動子處組蛋白3的乙?；剑龠MLPS觸發(fā)的IL-6的產(chǎn)生[3]。Huang等[4]通過對胰腺導管原位癌異種移植模型篩選，發(fā)現(xiàn)BRD3可能是腫瘤生長的關鍵調(diào)控因子。

BRD4有3種表達形式，1種長切型（1362個殘基），2種短切型（722和796個殘基），人體中多為長切型。長切型BRD4除了2個BD結(jié)構域和1個ET結(jié)構域，其末端還有一個羧基端結(jié)構域（CTD）。CTD通過募集正性轉(zhuǎn)錄延伸物（P-TEFb）到BRD4靶基因Cyclin T1和CDK9的乙?；M蛋白基因轉(zhuǎn)錄區(qū)，激活轉(zhuǎn)錄初始應答基因，并招募P-TEFb復合物，磷酸化RNA聚合酶Ⅱ（polⅡ），恢復轉(zhuǎn)錄延伸，促進轉(zhuǎn)錄進行[5]。ET結(jié)構域與組蛋白精氨酸區(qū)甲基酶（JMJD6）、染色質(zhì)DNA解螺旋DNA結(jié)合蛋白（CHD4）等多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子相互作用，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用[6]。BRD4不僅可以識別乙?；慕M蛋白，也可以識別乙?；姆墙M蛋白，如識別NF-κB亞基RelA，參與炎性反應、氧化應激反應等生物學過程。

BRDT與其他成員相比，很少在實體瘤中表達，而2010年在肺癌中首次發(fā)現(xiàn)了異常活化的BRDT。2017年，Bourova-Flin等[7]報道BRDT在肺癌中異?；罨念l率隨著組織學亞型的變化而變化，這表明當BRDT在睪丸以外的組織激活時，也具有潛在致癌性。

2 BET及其抑制劑與腫瘤

BET家族在人體組織廣泛表達，參與肥胖、肺纖維化、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）、癲癇等眾多疾病的發(fā)生和發(fā)展，而近年研究發(fā)現(xiàn)，其還參與腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移等過程。睪丸核蛋白中線癌（NUT midline carcinoma，NMC）、急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌等多種腫瘤均與BET家族的功能異常有關[8]。

BET家族的抑制劑主要包括二氮雜及其衍生物（JQ1、IBET762、OTX015）、喹啉酮類及其衍生物（PFI-1、RVX-208）、異噁唑類（IBET151）、四氫喹啉類（IBET726）、萘啶類等，目前關于BET抑制劑的10余項Ⅰ期藥物臨床實驗正在進行中，且在血液系統(tǒng)腫瘤中已初見成效[9]。

2.1 BET及其抑制劑與睪丸核蛋白中線癌

NMC是一種高侵襲性的低分化鱗狀細胞癌，容易轉(zhuǎn)移復發(fā)，男女發(fā)病率均等，可發(fā)生于任何年齡，常規(guī)放化療效果不佳，平均生存期小于1年。

約2/3的NMC有15號和19號染色體易位t（15;19），形成BRD4-NUT融合基因，破壞細胞分化，維持腫瘤細胞生長并驅(qū)動疾病。Wang等[10]通過基因陣列分析發(fā)現(xiàn)在NMC細胞中，BRD4-NUT融合蛋白的NUT部分被BRD4雙溴化域固定在染色質(zhì)上，刺激組蛋白高乙酰化，導致BRD4與染色質(zhì)結(jié)合得更緊密，并在核相關染色質(zhì)位點上招募多種BRD4相互作用因子，激活原位癌基因表達。NMC患者的芯片測序研究顯示，BRD4-NUT（B4N）覆蓋了較大的基因組區(qū)域，并在這些區(qū)域內(nèi)提升轉(zhuǎn)錄水平，促進NMC的發(fā)生[11]。小干擾RNA敲除BRD3/BRD4-NUT導致細胞增殖減少、細胞角蛋白表達與上皮分化一致，表明BRD4通過阻斷分化在促進癌細胞增殖中發(fā)揮重要作用。

BET抑制劑能在體外和體內(nèi)迅速誘導NMC細胞的分化，同時伴有高乙酰化核灶的消失。BET抑制劑治療NMC目前正在臨床試驗中（NCT02698176、NCT 01587703、NCT01987362、NCT02259114）。在一項關于IBET762的臨床實驗中報道10例NMC患者，2例患者獲得部分緩解，4例患者病情穩(wěn)定。另外一項研究將OTX015應用于4例經(jīng)證實的BRD4-NUT融合的晚期NMC患者，發(fā)現(xiàn)2例患者的癥狀迅速緩解，第3例患者的病情穩(wěn)定。這些數(shù)據(jù)為BET抑制劑治療NMC提供了部分證據(jù)，但通過靶向BRD4-NUT治療NMC，仍需要更多的臨床病例支持。

2.2 BET及其抑制劑與急性白血病

急性白血病是最常見的血液系統(tǒng)腫瘤，以臨床和生物學異質(zhì)性為特征，近年來隨著對白血病分子機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)表觀遺傳在調(diào)控急性白血病中具有重要作用。

MLL-融合白血病，包括70%的兒童急性淋巴細胞白血病和10%的成人急性髓細胞性白血?。ˋML），是表觀遺傳調(diào)控白血病的典型。MLL是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，MLL基因的N端可以與70多種伴侶基因融合，融合伴侶基因是轉(zhuǎn)錄延伸復合物（super elongation complex，SEC）的關鍵組成部分，SEC和P-TEFb復合物的功能異常導致異常轉(zhuǎn)錄延伸，從而驅(qū)動白血病的發(fā)生。蛋白質(zhì)組學方法已經(jīng)確定BRD3和BRD4是聚合酶相關因子復合物（PAFc）的組成部分，其參與MLL全息復合物到靶基因的定位，是驅(qū)動MLL-AF9白血病所必需的[12]。在體外細胞系中也證實了BRD4為白細胞生成所需的一種關鍵染色質(zhì)調(diào)節(jié)器。BET抑制劑通過從染色質(zhì)中去除BRD4-NSD3-CHD8復合物抑制轉(zhuǎn)錄，在白血病中發(fā)揮治療作用。Saenz等[13]發(fā)現(xiàn)BET抑制劑在繼發(fā)性髓系白血病中可以抑制細胞生長，誘導腫瘤細胞凋亡。蛋白水解-靶向嵌合體（PROTAC）ARV-825可以通過泛素途徑誘導BET蛋白降解，用ARV-825處理AML細胞可以引起B(yǎng)RD4的明顯耗竭和高水平的凋亡。

急性白血病的治療主要依靠藥物化療，而在傳統(tǒng)的化療方案中，<60歲的AML患者中，只有40%的患者存活時間超過5年。而近來的研究發(fā)現(xiàn)將BET抑制劑與傳統(tǒng)抗白血病藥物聯(lián)用有不錯的療效。Tontsch-Grunt等[14]在AML小鼠模型中將BET抑制劑BI 894999與PLK抑制劑volasertib聯(lián)合應用，結(jié)果表明與單用volasertib相比聯(lián)合應用可顯著降低腫瘤負荷。ABBV-075是一種強效選擇性BET抑制劑，體內(nèi)聯(lián)合研究發(fā)現(xiàn)低劑量ABBV-075聯(lián)合硼替佐米（Bortezomib）和阿扎胞苷（Azacitidine）治療急性白血病有不錯的效果[15]。

在已經(jīng)完結(jié)的一項Ⅰ期臨床實驗（NCT01713582）中，14例復發(fā)性或者治療相關性AML患者，接受口服OTX015治療，最終1例患者完全緩解，1例患者完全緩解伴血細胞計數(shù)不完全恢復[8]。涉及BET抑制劑治療白血病的臨床實驗還有多項（NCT01943851、NCT02158858、NCT02308761、NCT02391480、NCT025 43879、NCT02431260、NCT02683395、CT02711137）正在進行中，隨著臨床實驗的進一步開展，將為BET抑制劑治療白血病提供更堅實的證據(jù)。

2.3 BET及其抑制劑與乳腺癌

乳腺癌在女性常見惡性腫瘤中發(fā)病率居首位，是女性腫瘤死亡的主要原因之一。基于雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）的表達情況和人類表皮生長因子受體（HER2）的擴增狀態(tài)，乳腺癌可以分為3個亞型，即HER2陽性腫瘤、ER陽性腫瘤和三重陰性乳腺癌（TNBC）。

BRD2、BRD3和BRD4均在乳腺癌中有表達，Marcotte等[16]證明了BRD4是乳腺癌的核心驅(qū)動基因之一。同時研究者在乳腺癌細胞系中用shRNA沉默BRD4基因表達，抑制了乳腺癌細胞增殖，用BET抑制劑JQ1處理乳腺癌細胞，發(fā)現(xiàn)細胞周期進展緩慢，且誘導細胞凋亡。WHSC1是一種組蛋白H3K36甲基轉(zhuǎn)移酶，BRD3和BRD4可招募WHSC1到ERα基因，并促進ERα基因表達，BET抑制劑JQ1可以強有力地抑制ERα信號通路和乳腺癌細胞的生長[17]。最近，Andrieu等[18]也發(fā)現(xiàn)BRD2可調(diào)控上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），促進乳腺癌轉(zhuǎn)移。用BET蛋白降解劑BETd-246B處理人TNBC細胞及小鼠異種移植模型，可以誘導BET蛋白降解，顯示出強大的抗腫瘤活性，表明針對BET蛋白進行降解是TNBC治療的有效策略。

綜上所述，BET家族在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，BET抑制劑在乳腺癌中的Ⅰ期臨床試驗（NCT02964507、NCT02983604）正在進行中，隨著研究的深入，BET家族有望成為新型抗乳腺癌的靶點。

2.4 BET及其抑制劑與肺癌

肺癌在惡性腫瘤中死亡率占第一位，按病理分型可以分為小細胞肺癌（約占15%）及非小細胞肺癌（約占85%）。肺癌發(fā)病的確切分子機制仍不清楚，近年來的研究發(fā)現(xiàn)BET家族可能參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展。

ASCL1是一種致癌因子，在小細胞肺癌標本中的表達超過50%。染色質(zhì)免疫沉淀證實BRD4與ASCL1增強子結(jié)合，而JQ1可以破壞這種結(jié)合[19]。Liao等[20]發(fā)現(xiàn)在非小細胞肺癌組織和細胞系中BRD4表達顯著上調(diào)，抑制BRD4的表達，減弱細胞侵襲，抑制細胞增殖，且BRD4水平與非小細胞肺癌的腫瘤分期、不良預后顯著相關。

小細胞肺癌的治療以化療為主，近30年來沒有新的靶向藥物被批準用于小細胞肺癌患者。Lam等[21]的研究表明，大約50%的小細胞肺癌細胞系對BET抑制劑ABBV-075的生長抑制極為敏感，且ABBV-075在大多數(shù)小細胞肺癌細胞系通過caspase-3/7途徑誘導了凋亡，當用BET抑制劑和venetoclax（ABT-199）聯(lián)合處理小細胞肺癌細胞時，在體外和體內(nèi)都觀察到強協(xié)同作用。Zhang等[22]近期的研究表明I-BET762在臨床前肺癌小鼠模型中通過靶向腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境顯著延遲了腫瘤的發(fā)展。放射治療是晚期非小細胞肺癌局部治療的重要手段，而放射抗性明顯地削弱了其療效，BET抑制劑JQ1可顯著增強非小細胞肺癌細胞系中的輻照效應[23]。用BET抑制劑處理非小細胞肺癌模型也發(fā)現(xiàn)凋亡調(diào)控因子FLIP和XIAP的表達呈高度BET依賴性，且BET抑制劑JQ1聯(lián)合化療藥物順鉑顯著提高了A549荷瘤小鼠的抗腫瘤療效。這表明BET抑制劑與促凋亡化合物的結(jié)合是克服治療耐藥性的重要策略。

涉及BET抑制劑在肺癌中的臨床實驗（NCT0225 9114、NCT02698176）正在進行中，這些研究將為BET抑制劑在臨床的應用進一步提供證據(jù)。

3 BET抑制劑的副作用與耐藥

雖然已經(jīng)取得了不少成果，但BET抑制劑缺乏對于BET家族成員的選擇性，耐藥以及副作用都限制著其在臨床的應用。

目前已有10余種BET家族的抑制劑進入臨床試驗，但絕大多數(shù)都是非選擇性的，特異性不佳，因此，研發(fā)對BET家族成員具有特異性的新型抑制劑可能成為目前的新方向。隨著BET抑制劑的應用，耐藥也成為一個不可忽視的問題。在白血病和一部分實體瘤中都發(fā)現(xiàn)MEK通路參與了BET抑制劑的耐藥[24]。此外，去泛素化蛋白酶DUB3也可以引起B(yǎng)ET蛋白尤其BRD4的上調(diào)，從而介導對BET抑制劑的耐藥[25]。然而，BET耐藥的確切機制目前尚不清楚，仍需進一步研究。BET抑制劑的副作用主要表現(xiàn)在血液系統(tǒng)和消化系統(tǒng)。在一項OTXO15的Ⅰ期臨床試驗中，40例急性白血病患者接受OTXO15治療，其中發(fā)生腹瀉14例（34%）、惡心9例（22%）、疲勞11例（27%），且出現(xiàn)頻率隨著劑量增加而增加，但所有副作用在停藥10 d后可消失[26]。其他臨床試驗也報道了BET抑制劑引起的血小板減少癥、疲勞、高膽紅素血癥等副作用[27]。因此，BET抑制劑的安全性尚需要更多臨床試驗來證實。

綜上所述，BET家族通過調(diào)控細胞周期、增殖分化、凋亡自噬等生物學過程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。以BET家族為靶點的單獨治療或聯(lián)合其他抗腫瘤藥物的綜合治療也顯示了良好的效果。盡管BET抑制劑的特異性、耐藥、副作用等問題需要進一步解決，抗腫瘤的確切機制也需進一步探索，但相信隨著研究的深入，以BET家族作為抗腫瘤的新靶點將具有不錯的前景。

[參考文獻]

[1]? Ferri E，Petosa C，McKenna CE. Bromodomains：Structure，function and pharmacology of inhibition [J]. Biochem Pharmacol，2016，106：1-18.

[2]? Cheung KL，Zhang F，Jaganathan A，et al. Distinct Roles of Brd2 and Brd4 in Potentiating the Transcriptional Program for Th17 Cell Differentiation [J]. Mol Cell，2017，65（6）：1068-1080.e5.

[3]? Jung M，Gelato KA，F(xiàn)ernández-Montalván A，et al. Targeting BET bromodomains for cancer treatment [J]. Epigenomics，2015，7（3）：487-501.

[4]? Huang Y，Nahar S，Nakagawa A，et al. Regulation of GLI Underlies a Role for BET Bromodomains in Pancreatic Cancer Growth and the Tumor Microenvironment [J]. Clin Cancer Res，2016，22（16）：4259-4270.

[5]? Sakurai N，Inamochi Y，Inoue T，et al. BRD4 regulates adiponectin gene induction by recruiting the P-TEFb complex to the transcribed region of the gene [J]. Sci Rep，2017，7（1）：11962.

[6]? Konuma T，Yu D，Zhao C，et al. Structural Mechanism of the Oxygenase JMJD6 Recognition by the Extraterminal（ET）Domain of BRD4 [J]. Sci Rep，2017，7（1）：16272.

[7]? Bourova-Flin E，Chuffart F，Rousseaux S，et al. The Role of Bromodomain Testis-Specific Factor，BRDT，in Cancer：A Biomarker and A Possible Therapeutic Target [J]. Cell J，2017，19（Suppl 1）：1-8.

[8]? Stathis A，Bertoni F. BET Proteins as Targets for Anticancer Treatment [J]. Cancer Discov，2018，8（1）：24-36.

[9]? Xu Y，Vakoc CR. Targeting Cancer Cells with BET Bromodomain Inhibitors [J]. Cold Spring Harb Perspect Med，2017，7（7）. Pii：a026674.

[10]? Wang R，You J. Mechanistic analysis of the role of bromodomain-containing protein 4（BRD4）in BRD4-NUT oncoprotein-induced transcriptional activation [J]. J Biol Chem，2015，290（5）：2744-2758.

[11]? Zee BM，Dibona AB，Alekseyenko AA，et al. The Oncoprotein BRD4-NUT Generates Aberrant Histone Modification Patterns [J]. PLoS One，2016，11（10）：e0163820.

[12]? Saygin C，Carraway HE. Emerging therapies for acute myeloid leukemia [J]. J Hematol Oncol，2017，10（1）：93.

[13]? Saenz DT，F(xiàn)iskus W，Manshouri T，et al. BET protein bromodomain inhibitor-based combinations are highly active against post-myeloproliferative neoplasm secondary AML cells [J]. Leukemia，2017，31（3）：678-687.

[14]? Tontsch-Grunt U，Rudolph D，Waizenegger I，et al. Synergistic activity of BET inhibitor BI 894999 with PLK inhibitor volasertib in AML in vitro and in vivo [J]. Cancer Lett，2018，421：112-120.

[15]? Bui MH，Lin X，Albert DH，et al. Preclinical Characterization of BET Family Bromodomain Inhibitor ABBV-075 Suggests Combination Therapeutic Strategies [J]. Cancer Res，2017，77（11）：2976-2989.

[16]? Marcotte R，Sayad A，Brown KR，et al. Functional Genomic Landscape of Human Breast Cancer Drivers，Vulnerabilities，and Resistance [J]. Cell，2016，164（1/2）：293-309.

[17]? Feng Q，Zhang Z，Shea MJ，et al. An epigenomic approach to therapy for tamoxifen-resistant breast cancer [J]. Cell Res，2014，24（7）：809-819.

[18]? Andrieu GP，Denis GV. BET Proteins Exhibit Transcriptional and Functional Opposition in the Epithelial-to-Mesenchymal Transition [J]. Mol Cancer Res，2018，16（4）：580-586.

[19]? Lenhart R，Kirov S，Desilva H，et al. Sensitivity of Small Cell Lung Cancer to BET Inhibition Is Mediated by Regulation of ASCL1 Gene Expression [J]. Mol Cancer Ther，2015，14（10）：2167-2174.

[20]? Liao YF，Wu YB，Long X，et al. High level of BRD4 promotes non-small cell lung cancer progression [J]. Oncotarget，2016，7（8）：9491-9500.

[21]? Lam LT，Lin X，F(xiàn)aivre EJ，et al. Vulnerability of Small-Cell Lung Cancer to Apoptosis Induced by the Combination of BET Bromodomain Proteins and BCL2 Inhibitors [J]. Mol Cancer Ther，2017，16（8）：1511-1520.

[22]? Zhang D，Leal AS，Carapellucci S，et al. Chemoprevention of Preclinical Breast and Lung Cancer with the Bromodomain Inhibitor I-BET 762 [J]. Cancer Prev Res（Phila），2018，11（3）：143-156.

[23]? Wang J，Wang Y，Mei H，et al. The BET bromodomain inhibitor JQ1 radiosensitizes non-small cell lung cancer cells by upregulating p21 [J]. Cancer Lett，2017，391：141-151.

[24]? Wyce A，Matteo JJ，F(xiàn)oley SW，et al. MEK inhibitors overcome resistance to BET inhibition across a number of solid and hematologic cancers [J]. Oncogenesis，2018，7（4）：35.

[25]? Jin X，Yan Y，Wang D，et al. DUB3 Promotes BET Inhibitor Resistance and Cancer Progression by Deubiquitinating BRD4 [J]. Mol Cell，2018，71（4）：592-605.e4.

[26]? Berthon C，Raffoux E，Thomas X，et al. Bromodomain inhibitor OTX015 in patients with acute leukaemia：a dose-escalation，phase 1 study [J]. Lancet Haematol，2016，3（4）：e186-195.

[27]? Lewin J，Soria JC，Stathis A，et al. Phase Ib Trial With Birabresib，a Small-Molecule Inhibitor of Bromodomain and Extraterminal Proteins，in Patients With Selected Advanced Solid Tumors [J]. J Clin Oncol，2018：JCO2018 782292.

（收稿日期：2018-09-05? 本文編輯：張瑜杰）