余 冬，馮 霜，李 俊，孫晉津

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肝膽胰外科，天津300211）

胰腺癌是一種高致死率的疾病，惡性程度高，早期診斷困難，手術(shù)切除率低，對放化療不敏感，容易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差[1]。近年來，由于癌癥的早期發(fā)現(xiàn)和治療方案的改善，大多數(shù)常見惡性腫瘤的5年生存率有所升高，但胰腺癌的生存率未見明顯改善，其5年生存率僅為8%[2]。因此尋求新的診斷及治療策略以達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的目的尤為迫切。microRNA（miRNA）是一類長度約為22個核苷酸（nt）的非編碼單鏈小RNA分子，在細(xì)胞內(nèi)由70～80 nt的單鏈RNA前體經(jīng)Dicer酶剪切加工而來。miRNA可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生和抑制、腫瘤的診斷和結(jié)局發(fā)揮重要作用[3]。有研究表明 miR-199a-3p 參與卵巢癌[4]、肝癌[5]、骨肉瘤[6]、結(jié)直腸癌[7]等多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展。然而，關(guān)于miR-199a-3p在胰腺腺癌中的研究及作用機(jī)制卻鮮有報道，其相關(guān)的作用機(jī)制仍有待明確和解決。GEO（GeneExpression Omnibus）數(shù)據(jù)庫是目前最大的完全公開的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫，包括大量的基因微陣列和各種形式的高通量基因測序數(shù)據(jù)，并且可供自由下載和研究分析[8]。本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫的miRNA的測序數(shù)據(jù)，綜合各個生物信息學(xué)分析軟件，利用相關(guān)統(tǒng)計學(xué)方法，研究胰腺癌中的miR-199a-3p表達(dá)水平及其生物學(xué)功能。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)資料及納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 從GEO數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus,http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載胰腺癌的miRNA數(shù)據(jù)，在GEO數(shù)據(jù)庫使用如下關(guān)鍵字進(jìn)行檢索：（pancreas OR pancreatic）AND（cancer OR carcinoma OR tumor OR neoplasm*OR malignant*OR adenocarcinoma）AND（microRNA OR miRNA OR“micro RNA”）。芯片數(shù)據(jù)的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所測為人的胰腺癌樣本，包括非編碼RNA芯片數(shù)據(jù)；（2）有正常對照（包括正常胰腺組織或癌旁組織），至少超過2例；（3）芯片數(shù)據(jù)可以用來計算和對比。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）數(shù)據(jù)中無miR-199a-3p 相關(guān)可用的數(shù)據(jù)；（2）樣本為血液的；（3）樣本是胰腺癌細(xì)胞系的；（4）數(shù)據(jù)中不只有人的樣本；（5）樣本有藥物等其他因素的干擾。

1.2 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，miR-199a-3p表達(dá)數(shù)據(jù)用±s表示，student’T用于兩獨(dú)立樣本的檢驗，ROC曲線用于檢驗miR-199a-3p數(shù)據(jù)的診斷價值；review manager 5.3進(jìn)行Meta分析,卡方檢驗和I2檢驗用于數(shù)據(jù)的異質(zhì)性檢驗，P＜0.05或I2＞50%表示有顯著異質(zhì)性，并且應(yīng)用隨機(jī)效應(yīng)模型，否則，選擇固定效果模型。森林圖用于檢驗數(shù)據(jù)的偏移，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 miR-199a-3p生物信息學(xué)分析 用7個基因預(yù)測平臺，包括 TargetScan[9]、MirDB[10]、DIANAmicroT[11]、miRWalk[12]、PITA[13]、RNA22[14]and NBmiRTar[15]預(yù) 測miR-199a-3p的靶基因。所預(yù)測的全部靶基因取其交集，至少被4個平臺同時預(yù)測到的基因納入潛在的靶基因。對全部潛在的靶基因利用DAVID在線分析工具[16]對GO功能和KEGG通路進(jìn)行富集分析。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)收集 GEO數(shù)據(jù)庫最終收集到6個胰腺癌的miR-199a-3p表達(dá)數(shù)據(jù)，分別是GSE24279、GSE32678、GSE41372、GSE43796、GSE60978、GSE71533，6 個GEO數(shù)據(jù)的信息如圖1所示，GSE24279、GSE41372、GSE60978、GSE71533數(shù)據(jù)中胰腺癌的miR-199a-3p表達(dá)水平的平均值都高于正常胰腺組織，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別是P＜0.001、P=0.003、P=0.001、P＜0.001）。從 ROC 曲 線 可 以 看 出 ，GSE24279、GSE41372、GSE60978、GSE71533數(shù)據(jù)中胰腺癌表現(xiàn)出具有顯著意義的診斷價值，對應(yīng)的受試者工作特征曲線如圖2所示。

圖1 6個GEO數(shù)據(jù)庫中miR-199a-3p在胰腺癌和正常對照中的表達(dá)水平Fig 1 Expression of miR-199a-3p in pancreatic cancer and normal pancreatic tissues in six GEO databases

圖2 4個GEO數(shù)據(jù)中胰腺癌的miR-199a-3p的ROC曲線Fig 2 The ROC curve of miR-199a-3p in pancreatic cancer in four GEO databases.

2.2 Meta分析結(jié)果 6個數(shù)據(jù)庫中胰腺癌miR 199a-3p的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行meta分析，異質(zhì)性檢驗顯示P＜0.05或I2＞50%，應(yīng)用隨機(jī)效應(yīng)模型，SMD（標(biāo)準(zhǔn)均數(shù)差）為 1.36（95%CI：1.03-1.69，P＜0.001），Meta 分析顯示胰腺癌和正常胰腺組織的miR-199a-3p的表達(dá)水平有差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)分析結(jié)果、森林圖、漏斗圖如圖3所示。

2.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果 預(yù)測221個miR-199a-3p潛在的靶基因。GO功能富集分析表明靶基因的功能主要富集在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)，蛋白質(zhì)域特異性結(jié)合等生物學(xué)過程（P＜0.001）。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示主要富集在PI3K-Akt通路、黏著斑、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、癌癥通路、Hippo通路、鞘脂通路、ErbB通路、MAPK通路等通路（P＜0.05）。各項預(yù)測結(jié)果的前10項如表1所示。

圖3 胰腺癌和正常胰腺組織之間的miR-199a-3p表達(dá)水平的組合SMD的森林圖（A）和漏斗圖（B）Fig 3 Forestplot（A）and funnelplot（B）of the combined SMD for miR-199a-3pexpression between pancreatic cancer and normal pancreatic tissues

表1 GO富集分析和KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析結(jié)果各項預(yù)測的前10項Tab 1 Ten result smost strongly enriched by GO analysis and KEGG pathways analysis

3 討論

目前miRNA是各個疾病和腫瘤的基因調(diào)控中重要組成部分，廣泛參與生物體內(nèi)的信號通路的調(diào)控及生物學(xué)行為。已經(jīng)有越來越多的研究指出miR-199a-3p在各個癌癥中基因表達(dá)、分子調(diào)控等方面都發(fā)揮著重要的作用。Kinose等[17]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中miR 199a-3p的靶基因為MET，并可通過降低c-Met的表達(dá)來抑制卵巢癌的進(jìn)展，有望成為治療卵巢癌播散的潛在靶標(biāo)。Huang等[18]得出miR-199a-3p在腎癌中下調(diào)，其可抑制細(xì)胞增殖，且可抑制c-Met及其下游信號通路的表達(dá)。在結(jié)直腸癌中，Han等[19]證明NLK是miR-199a-3p一個靶基因，NLK的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。在骨肉瘤中，Tian等[20]發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p呈低表達(dá)，通過下調(diào)AXL mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)而負(fù)向促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展，且和AKT途徑調(diào)節(jié)骨肉瘤的進(jìn)展相關(guān)。Koshizuka等[21]證明在頭頸部腫瘤中miR-199a-3p靶向調(diào)節(jié)ITGA3來抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和進(jìn)展。在上述的腫瘤中miR-199a-3p調(diào)控相應(yīng)的靶基因和信號通路并發(fā)揮著抑癌作用。而關(guān)于胰腺癌中miR-199a-3p的表達(dá)情況和作用機(jī)制的研究少見文獻(xiàn)報道，僅有少部分對胰腺癌中miRNA的研究中有提及miR-199a-3p。國外有研究對5例胰腺癌和5例正常胰腺組織進(jìn)行miRNA微陣列研究，結(jié)果分析顯示胰腺癌中miR-199a-3p表達(dá)水平相比于正常胰腺組織呈上調(diào)[22]。值得注意的是在另一項研究中，通過65例胰腺癌和相應(yīng)的正常胰腺組織行miRNA微陣列研究，得到相同的研究結(jié)果[23]。然而在國內(nèi)的一項研究中，利用miRNA芯片技術(shù)篩選胰腺癌差異miRNA表達(dá)譜時，得出胰腺癌中miR-199a-3p呈下調(diào)，但正常胰腺與胰腺癌之間表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義[24]。因此miR-199a-3p在胰腺癌中的表達(dá)尚不確切。另一方面，僅有檢索到兩篇文獻(xiàn)有報道m(xù)iR-199a-3p在胰腺癌的作用機(jī)制。其中之一發(fā)現(xiàn)在胰腺腫瘤中miR-199a-3p主要調(diào)節(jié)胰腺星狀細(xì)胞的活化與促腫瘤效應(yīng)，miR-199a-3p可作為靶向治療的潛在靶點(diǎn)[25]。另一篇研究表明基因型的變異可干擾miR-199a/HIF1A調(diào)節(jié)環(huán)的調(diào)節(jié)來改變胰腺癌的風(fēng)險和預(yù)后[26]。從目前的研究現(xiàn)狀來看，miR-199a-3p在胰腺癌中的表達(dá)情況和機(jī)制仍未完全闡明，仍需進(jìn)一步深入的研究。

本研究中，通過篩選并比較GEO數(shù)據(jù)庫中胰腺癌和正常胰腺組織中miR-199a-3p的表達(dá)水平，綜合多組GEO數(shù)據(jù)并進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)胰腺癌中miR-199a-3p的表達(dá)水平高于正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），4項數(shù)據(jù)的ROC曲線表明miR-199a-3p有著一定的診斷價值，可能成為一種新的診斷指標(biāo)，為胰腺癌的早期診斷提供方向。miRNA主要與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）互補(bǔ)配對，調(diào)節(jié)靶基因mRNA降解和蛋白合成，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄后靶基因的表達(dá)水平，最終影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡等功能?；蛘{(diào)控是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，利用生物信息學(xué)分析miR-199a-3p與其相關(guān)的靶基因，并探索靶基因的作用，以進(jìn)一步了解miR-199a-3p的功能。本研究綜合數(shù)個靶基因預(yù)測平臺，更廣泛的收集預(yù)測到靶基因，但同時也可能帶來一定的差異性。對miR-199a-3p的靶基因GO功能分析，得出其主要富集在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)，蛋白質(zhì)域特異性結(jié)合等重要的生物學(xué)過程。靶基因的KEGG信號通路富集分析結(jié)果主要富集在PI3K-Akt信號通路、黏著斑、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、癌癥通路、Hippo信號通路、鞘脂信號通路、ErbB信號通路、MAPK信號通路等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。已經(jīng)有研究指出約50%的胰腺癌呈現(xiàn)PI3K信號傳導(dǎo)的激活增加，且和Akt的磷酸化有關(guān)，通常與腫瘤的未分化狀態(tài)相關(guān)并且與不良預(yù)后相關(guān)[27]。同樣也有研究報道MAPK信號通路[28]、ErbB信號通路[29]在胰腺癌中有著密切的聯(lián)系?？梢娚险{(diào)的miR-199a-3p可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，為胰腺癌的研究提供新的研究方向和理論依據(jù)。本研究的分析結(jié)果綜合了多個GEO數(shù)據(jù)庫，增加了信息的可靠性，也存在一定的局限性，結(jié)果的準(zhǔn)確性需實驗進(jìn)一步來驗證。