(西北礦冶研究院 甘肅 白銀 730900)

一、前言

近幾十年來，隨著世界經(jīng)濟(jì)的一體化發(fā)展，工業(yè)化規(guī)模也日趨龐大，大量人工合成的化學(xué)品釋放入環(huán)境?；瘜W(xué)污染物通過飲用水、食物、土壤和大氣等環(huán)境介質(zhì)與包括人類在內(nèi)的環(huán)境生物體系全方位地接觸，成為本世紀(jì)初急需治理的“第三代污染”，其對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康與生存可能帶來的潛在危害及其防治，成為新世紀(jì)的重大研究課題。經(jīng)過大量研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在各種原因?qū)е碌臋C(jī)體損傷，如肝損傷，神經(jīng)損傷中，占有十分重要的作用，其機(jī)制也得到越來越多的關(guān)注。

二、三氯乙烯簡介及研究進(jìn)展

三氯乙烯(Trichloroethylene,PCE)是一種常見的重要的工業(yè)有機(jī)溶劑，為無色液體，有類似氯仿的嗅味，分子量131.4，沸點(diǎn)86.7℃，易溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，不溶于水，具有較強(qiáng)的脫脂作用，可用做金屬脫脂劑、萃取劑、干洗劑、溶劑等，廣泛應(yīng)用于五金、電子、玩具、印刷等行業(yè)。在工業(yè)生產(chǎn)和使用過程中三氯乙烯可以通過呼吸道、消化道和皮膚吸收，由于作業(yè)人員通常是手工作業(yè)，致使皮膚直接接觸吸收在三氯乙烯的致病中具有非常重要的意義。

三、污染物對(duì)生物的影響

污染物通過多種途徑進(jìn)入生物機(jī)體后，一部分經(jīng)代謝排出體外，而有些污染物或污染物的代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生毒性作用。已有研究表明，污染物對(duì)生物機(jī)體的影響首先作用于生物大分子，在不同水平(器官、細(xì)胞、分子等)上引發(fā)各種各樣的毒性效應(yīng)。隨著對(duì)毒物危害機(jī)體的本質(zhì)逐步深入研究，目前有關(guān)化學(xué)物質(zhì)的毒作用機(jī)制主要包括：自由基與氧化損傷，外源性化合物共價(jià)結(jié)合，細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)紊亂等。

四、氧化損傷在神經(jīng)毒性中的作用

自由基氧化損傷是多種神經(jīng)功能紊亂以及腦功能紊亂的病理學(xué)原因之一，同時(shí)也和神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)。在正常情況下，體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的。當(dāng)自由基的產(chǎn)生過多或體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)出現(xiàn)故障，體內(nèi)氧自由基代謝就會(huì)出現(xiàn)失衡，自由基蓄積過多攻擊機(jī)體，即為氧化應(yīng)激。

氧化應(yīng)激不但可以直接損傷細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞壞死，它還可以通過介導(dǎo)線粒體途徑、DNA修復(fù)酶及轉(zhuǎn)錄因子等間接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

五、紫甘薯花青素簡介及研究進(jìn)展

紫甘薯花青素(Purple Sweet Potato Color,PSPC)是紫色甘薯(Ipomoea.Batatas Lam.)中提取的黃酮類化合物，其具有抗氧化和消除自由基、降低血清和肝臟中脂肪含量、抗突變、抗腫瘤、防止人體內(nèi)過氧化、提高視力等作用，紅色至紫紅色的粉狀物、糊狀物或液體，易溶于水、乙醇和丙酮等，不溶于石油醚等有機(jī)溶劑。因其吡喃環(huán)上有酚羥基以及四價(jià)氧原子，所以其同時(shí)具有酸和堿的性質(zhì)，對(duì)酸堿十分敏感，其色調(diào)和穩(wěn)定性易受PH值影響。己有實(shí)驗(yàn)證明PSPC具有抗衰老，抗輻射損傷，抗腫瘤等多種生物活性。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)PSPC降低炎癥的作用來研究PSPC對(duì)PCE誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷是否具有保護(hù)作用，具有一定的醫(yī)學(xué)和社會(huì)意義。

六、材料與方法

(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

8周齡雄性C57 BL/6J小鼠40只，體重為22.43±3.23g，動(dòng)物購自北京華阜康生物科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)開始前，動(dòng)物被飼養(yǎng)在室溫為23 1℃，濕度是60%房間里。小鼠被隨機(jī)分為4組每組10只，12小時(shí)有光/12小時(shí)黑暗(光照8：30-20：30)，小鼠可以自由飲水和進(jìn)食。在小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件后，隨機(jī)分為四組的小鼠收到不同的食物和飲水，分別為：(1)對(duì)照組；(2)PCE組；(3)PCE+PSPC組；(4)PSPC組。分別灌喂2000mg/kg/d的PCE，PCE+PSPC，PSPC，連續(xù)處理三周。進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和處理按照中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理的法規(guī)執(zhí)行。

(二)藥品與儀器

三氯乙烯(PCE)、紫甘薯花青素(PSPC)

LEICA CM1900恒冷切片機(jī)

LEICA SP5雙光子激光共聚焦

Biofuge primoR高速冷凍離心機(jī)(Heraeus)

高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf生產(chǎn)，型號(hào)為5810R)

ABI 2400 PCR儀

Bio-Rad凝膠成像分析儀

DYY-10型ECP300三恒電泳儀(北京市六一儀器廠)

DYCZP 40B型電泳槽(北京市六一儀器廠)

WD一9412A型恒溫循環(huán)器(北京市六一儀器廠)

WD-9405型水平搖床(北京市六一儀器廠沃德生物醫(yī)學(xué)儀器分廠)

MP200A電子天平

電動(dòng)勻漿器(聯(lián)邦德國Braun廠產(chǎn)品，型號(hào)為Potter-Elvehjem Tissue Grinders-1020259)

(三)組織樣品處理

最后一次灌喂PCE 24小時(shí)后，將小鼠用乙醚深度麻醉，處死，迅速取出腦組織，放于1/10(w/v)PBS(含蛋白酶抑制劑)中放于冰上勻漿后，5000×g，4℃，離心15min。收集上清液，放于-70℃儲(chǔ)藏，用于生化指標(biāo)的測(cè)定。

七、ROS的測(cè)定

(一)測(cè)定方法及原理

我們采用DCF二氯熒光法對(duì)小鼠大腦細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS進(jìn)行監(jiān)測(cè)，通過分析氯甲基二氫熒光素乙酯(CM-H2DCFDA)熒光探針最后產(chǎn)生的熒光密度而得出最終數(shù)值。CM-H2DCFDA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成H2DCF，而H2DCF不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的H2DCF生成強(qiáng)熒光的二氯熒光素DCF。通過檢測(cè)DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。

(二)操作方法

分離后的腦細(xì)胞組織液加入10μM二氯熒光乙酰乙酸鹽H2DCFDA于37℃孵育30min，用KHB緩沖液沖洗細(xì)胞三次洗掉多余染料后，用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長530nm條件下測(cè)定熒光密度值。沒有用染料處理的細(xì)胞用來檢測(cè)背景熒光值以去除本底干擾，最終熒光密度通過Bradford法對(duì)蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

八、藥物對(duì)機(jī)體內(nèi)ROS的影響

CTLPCEPCE+PSPCPSPCROS(pmolDCF formed/min/mg protein)2.57.63.12.4SD0.140.920.220.18

圖1藥物對(duì)ROS的影響

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是外源性氧化劑或細(xì)胞內(nèi)有氧代謝過程中產(chǎn)生的具有很高生物活性的氧分子，如O2-，·OH和脂質(zhì)過氧化物等。在特定條件下，低水平的氧自由基能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而活性氧被認(rèn)為在細(xì)胞凋亡過程中廣泛存在。

從圖1可以看出，用PCE染毒時(shí)，與對(duì)照組所測(cè)得的值相比，導(dǎo)致小鼠體內(nèi)ROS的含量迅速上升，且為最高，其值為7.6。用PCE和PSPC聯(lián)合作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)ROS的水平又有了大幅度的下降，下降至3.1，與對(duì)照組相比，還是要高于對(duì)照組。用PSPC染毒作用時(shí)，測(cè)得ROS值為2.4，與對(duì)照組相差無幾，基本視為無變化。

結(jié)語

在這個(gè)模型里，PCE可以導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)ROS含量升高，PSPC可以有效抑制PCE對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，減少ROS的值。表明PSPC能夠減弱PCE誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。