朱紫衣，王文博，劉 媛，江忠勇，常 凱，葉雨笙，熊 杰

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是引起慢性肝病的重要病原體之一，并且HCV感染通常不會(huì)產(chǎn)生適當(dāng)?shù)墓逃忻庖叻磻?yīng)，導(dǎo)致80%的感染者轉(zhuǎn)為慢性感染，其中一部分隨之誘發(fā)為HCV感染相關(guān)性肝硬化及肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。Toll樣受體(toll-like receptors,TLRs)作為一種病原體識(shí)別受體，在固有免疫和適應(yīng)免疫中發(fā)揮重要作用，其中最早被鑒定為TLRs的TLR4作為革蘭陰性細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)受體，具有抗細(xì)菌和抗病毒感染的作用[2]。既往研究[3-4]表明，LPS可以抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)登革熱病毒以及HIV的復(fù)制，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)[5-7]也表明LPS可以抑制HBV的復(fù)制，然而關(guān)于LPS體外對于HCV復(fù)制的影響尚未見報(bào)道。該研究擬通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)來研究LPS對HCV復(fù)制以及對Huh7Ⅰ型干擾素(interferon-Ⅰ,IFN-Ⅰ)信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料Huh7細(xì)胞及感染性HCV病毒顆粒(cell-culture-derived infectious HCV，HCVcc)由本實(shí)驗(yàn)室保存，Huh7培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，內(nèi)含10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和100 U/ml青霉素，置于 37 ℃、5% CO2、相對飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至融合，按1 ∶2或1 ∶3進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國GIBCO公司；脂多糖購自美國Sigma公司；TRIzol試劑盒、CCK8細(xì)胞增殖和毒性檢測試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞周期及凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；HCV感染者血清收集自本科室檢測標(biāo)本。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1LPS對Huh7生長增殖的影響 采用CCK8法。將Huh7按1×104個(gè)/孔接種96孔板，貼壁后分別加入濃度為100、10、1、0.1 mg/L的LPS，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入培養(yǎng)基總體積10%的CCK8溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值(OD)。

1.2.2LPS對HCV復(fù)制的影響 將Huh7按1×104個(gè)/孔接種96孔板，培養(yǎng)24 h后，以0.5感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI) HCVcc感染Huh7，并加入100 mg/L LPS，以未加LPS作為對照，培養(yǎng)24 h以及48 h后，用TRIzol試劑抽提細(xì)胞總RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3免疫熒光(IFA)檢測LPS對HCVcc感染 Huh7的影響Huh7按1×104個(gè)/孔接種96孔板，24 h后加入0.5 MOI HCVcc，并加入LPS,48 h后棄上清液，PBS洗2遍，加入甲醇100 μl/孔，置于-20 ℃ 冰箱固定20 min，PBS洗1遍，加入3% BSA，室溫封閉2 h；而后加入用100 μl HCV感染者血清(1 ∶100)，室溫孵育2 h后，PBS洗滌3次，加入Alex-488羊抗人IgG(1 ∶100)，避光孵育40 min后，用PBS洗滌2遍，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4LPS對Huh7細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響 將對數(shù)生長期的Huh7按1×105個(gè)/ml接種6孔板，貼壁后加入100 mg/L LPS,48 h后消化、離心收集細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC后，再加入5 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)混勻，室溫、避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

Huh7按1×105個(gè)/ml接種6孔板，貼壁后更換不含血清的培養(yǎng)基，使其同步，8 h后加入100 mg/L的LPS，孵育48 h后消化、離心收集細(xì)胞，70%冰乙醇固定24 h后，PBS洗滌、離心，加入PI染色工作液，避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.5Real-time PCR 按照TRIzol試劑盒說明書操作，提取待測細(xì)胞總RNA，并以之為模板采用SYBRGreen法進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng)，以GAPDH作為內(nèi)參基因，反應(yīng)條件為：45 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s,循環(huán)進(jìn)行40次，采用2-ΔΔCt法分析各處理組HCV RNA水平。所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體引物序列如下：HCV上游引物：5′-CTTCACGCAGAAAGCGTCTA-3′，下游引物：5′-CAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′；GAPDH上游引物:5′-TGGGCTACACTGAGCACCAG-3′，下游引物:5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT-3′。

1.2.6Western blot檢測IFN-α、IFN-β蛋白水平 將Huh7調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml接種到24孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁長至70%時(shí)，分別加入100 mg/L LPS以及0.5 MOI HCVcc，分別孵育2、4 h后預(yù)冷PBS洗滌2次，裂解、提取蛋白進(jìn)行蛋白定量檢測。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜、封閉，再分別孵育鼠抗IFN-α抗體(1 ∶500)、兔抗IFN-β抗體(1 ∶500)、鼠抗GAPDH 抗體(1 ∶1 000)，4 ℃過夜；TBST洗膜3次，每次10 min，加二抗(1 ∶1 000)，室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，使用BCIP/NBT堿性磷酸脂酶顯色試劑盒進(jìn)行顯色。Image J軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 LPS對Huh7的細(xì)胞增殖的影響Huh7接種96孔板，加入不同濃度的LPS，24 h及48 h后行CCK8試驗(yàn)，檢測細(xì)胞增殖活性。本研究實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)進(jìn)行3次，結(jié)果見圖1、表1。與對照組比較，10 mg/L LPS對Huh7有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用(P<0.05)，余各濃度LPS對Huh7生長增殖無明顯影響(P>0.05)，因此余后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用100 mg/L處理。

圖1 不同濃度的LPS對Huh7細(xì)胞增殖的影響

2.2 LPS在細(xì)胞水平上抑制對HCV的感染及復(fù)制結(jié)果顯示用100 mg/L LPS處理細(xì)胞后，HCV mRNA顯著降低，24 h對照組和實(shí)驗(yàn)組(LPS 100 mg/L)HCV相對mRNA水平分別為(0.902±0.169)、(0.269±0.138)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.016，P=0.007)；48 h對照組和實(shí)驗(yàn)組HCV相對mRNA水平分別為(0.930±0.121)、(0.647±0.065)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.567，P=0.023)，見圖2。

圖2 LPS對HCV復(fù)制的影響

表1 各濃度LPS處理組的OD450 nm值

為進(jìn)一步明確LPS對HCV感染的抑制作用，以HCV感染者血清為一抗，通過免疫熒光法檢測LPS處理Huh7后細(xì)胞內(nèi)抗核心蛋白抗體的表達(dá)。結(jié)果如圖3所示，100 mg/L的LPS處理組HCV結(jié)構(gòu)蛋白水平明顯減低。

2.3 LPS對Huh7細(xì)胞周期和凋亡的影響通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡，結(jié)果如圖4所示：以100 mg/L LPS作用于Huh7 48 h后，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率減低，分別為(2.130±0.001)% 、(1.070±0.002)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.314，P=0.001)。LPS作用Huh7 48 h后，細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)入分裂期(G2+M期)的細(xì)胞比例明顯低于對照組，而S期細(xì)胞明顯增多(圖5、表2)。

表2 LPS對Huh7細(xì)胞周期的影響

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4 LPS對Huh7細(xì)胞IFN-α、IFN-β表達(dá)的影響結(jié)果如圖6所示，LPS刺激細(xì)胞后，IFN-α、IFN-β均表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。HCV感染引起IFN-α、IFN-β表達(dá)增加，尤其是IFN-β；此外，LPS抑制了HCV引起的IFN-β的表達(dá)上調(diào)，但對IFN-α表達(dá)無明顯影響。

圖3 以HCV感染者血清為一抗檢測Huh7細(xì)胞中的HCV蛋白表達(dá)×100

A：對照組；B：0.1 mg/L LPS；C：1 mg/L LPS ；D：10 mg/L LPS；E：100 mg/L LPS

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球約有1.85億人感染HCV ，HCV感染已成為全球關(guān)注的重要公共健康問題[8-9]。近年來，直接抗病毒藥物(DAA)藥物的上市為HCV的患者帶來了福音[10]，但DAA藥物價(jià)格昂貴，且安全性和有效性有待于長期追蹤。TLR在防御病原體感染發(fā)揮重要作用，病毒感染能夠刺激TLR信號，使機(jī)體發(fā)揮免疫清除的作用。然而，HCV感染激活TLR信號的同時(shí)，也通過不同機(jī)制損害TLR信號，從而逃避免疫清除，所以理論上來說通過使用TLR激動(dòng)劑恢復(fù)TLR信號是一種潛在的治療方法[11]。本研究顯示TLR4的配體LPS可以在細(xì)胞水平抑制HCV的復(fù)制及感染。細(xì)胞凋亡與周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LPS處理后能夠使Huh7細(xì)胞凋亡減低，S期細(xì)胞明顯增多，這與既往研究[12]結(jié)果相符。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)也說明100 mg/L LPS對Huh7細(xì)胞生長增殖無明顯作用，說明LPS抑制HCV的復(fù)制與感染并非通過細(xì)胞毒性作用來實(shí)現(xiàn)的。

圖4 LPS對Huh7細(xì)胞凋亡的影響

圖5 LPS對Huh7細(xì)胞周期的影響

圖6 Western blot法檢測IFN-α、IFN-β蛋白的表達(dá)情況

A:IFN-α;B:IFN-β;與未處理組比較：*P<0.05；與HCV組比較：#P<0.05

IFN-Ⅰ能夠抵抗多種病原體的感染，且HCV刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生抗病毒和免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)主要是IFN-Ⅰ[13]，本研究檢測LPS對Huh7細(xì)胞IFN-Ⅰ信號通路影響，以期為LPS抑制HCV的復(fù)制提供些許理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LPS刺激細(xì)胞后，IFN-α、IFN-β均表達(dá)上調(diào)，而IFN-α、IFN-β參與抑制HCV的復(fù)制是非常明確的[14]。Barjesteh et al[15]認(rèn)為TLR配體處理雞巨噬細(xì)胞后可抑制禽流感病毒的復(fù)制，可能與其配體誘導(dǎo)IFN-α、IFN-β等抑制病毒復(fù)制的基因表達(dá)增加有關(guān)，但未對TLR配體對流感病毒感染引起的相關(guān)抗病毒基因的表達(dá)影響進(jìn)行研究。本研究顯示HCV感染可以迅速激活I(lǐng)FN-Ⅰ信號通路，使IFN-α、IFN-β表達(dá)上調(diào)，同時(shí)LPS抑制了HCV感染引起的IFN-β表達(dá)上調(diào)，而對IFN-α表達(dá)無明顯影響。這說明LPS可能通過干擾HCV感染細(xì)胞引起天然免疫應(yīng)答，從而影響HCV的感染與復(fù)制，但LPS具體通過何種機(jī)制影響病毒感染引起干擾素信號通路表達(dá)變化，尚未見明確報(bào)道，有待于進(jìn)一步研究。