侯梓園 石雅峰 姚遠 潘寶平 閆春財

摘要[目的]研究青蛤（Cyclinasinensis）ERK基因的克隆及在PolyI：C刺激下的表達情況。[方法]在已建立的青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選得到青蛤細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellularregulatedproteinkinases）基因類似序列。運用生物信息學軟件在線對該基因進行結(jié)構(gòu)分析。采用PCR技術(shù)克隆基因，并使用實時熒光定量PCR技術(shù)克隆得到CsERK基因在青蛤5個不同組織中的表達情況及在干擾素誘導劑PolyI：C的刺激下ERK基因在青蛤血淋巴中的時序性表達情況。[結(jié)果]ERK基因序列全長為2407bp，開放閱讀框長1338bp，共編碼445個氨基酸。ERK基因在青蛤的血淋巴、外套膜、閉殼肌、肝臟和鰓5個組織中均表達，在血淋巴中表達量最高，閉殼肌中表達量最低。青蛤ERK基因在PolyI：C脅迫下表達量在6h時達到最大值，與對照組相比差異極顯著（P<0.01）。[結(jié)論]ERK基因所指導合成的蛋白是青蛤重要的免疫信號通路蛋白。

關鍵詞青蛤;ERK基因;PolyI：C;熒光定量PCR

中圖分類號S944.4文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0099-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.031

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

青蛤（Cyclinasinensis）是一種常見的海產(chǎn)經(jīng)濟貝類，其食用味道好而且具有很高的營養(yǎng)價值，青蛤養(yǎng)殖是我國海產(chǎn)品養(yǎng)殖的支柱型產(chǎn)業(yè)，青蛤本身具有重要的藥用價值[1]。但是隨著近年來我國水產(chǎn)行業(yè)大環(huán)境的惡化，青蛤在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)了大規(guī)模的病害和死亡現(xiàn)象，給近海地區(qū)的經(jīng)濟帶來了巨大的損失[2]。對青蛤的健康養(yǎng)殖、抗病害機制及免疫調(diào)控的研究迫在眉睫，這一研究不僅可以為解決青蛤在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的死亡現(xiàn)象提供初步的理論研究結(jié)果，而且可以為進一步研究青蛤及其他無脊椎動物的免疫方式積累重要的試驗依據(jù)。

Toll樣受體（tolllikereceptors，TLR）是原始且保守的免疫系統(tǒng)受體之一[3]。Toll樣受體信號通路主要用于調(diào)控一些參與免疫的蛋白表達。細胞外刺激作用于細胞需要通過MAPK信號介導的三級激酶級聯(lián)反應[4]。而細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellularregulatedproteinkinases，ERK）是MAPK家族中的一員，它是將信號從表面受體傳導至細胞核的關鍵。在脊椎動物中已有ERK基因的相關研究，但ERK基因在軟體動物中的相關研究鮮見報道。

聚肌胞苷酸（polyinosinic：polycytidylicacid，PolyI：C）是一種人工合成的雙鏈RNA，可模擬病毒進行試驗[5]。作為一種高效的誘導劑，聚肌胞苷酸可在魚類等海產(chǎn)品及臨床醫(yī)學的小鼠模型研究中作為病毒類似物進行侵染試驗。該試驗中，通過PolyI：C體外注射得到ERK干擾后的基因，以其為模板測定表達量的變化。

免疫生物學研究是水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害防治的理論基礎。青蛤只具有先天性免疫系統(tǒng)，而抗生素的使用會使生物產(chǎn)生抗藥性。所以，研究貝類免疫相關因子的作用機制在發(fā)展水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中刻不容緩。免疫增強劑的研發(fā)和使用將在極大程度上發(fā)揮貝類的先天特異性免疫調(diào)節(jié)功能，大大提高貝類抵御病原體的能力，對水環(huán)境保護、貝類增養(yǎng)殖業(yè)以及水產(chǎn)品衛(wèi)生安全等都具有重要的意義[6]。

1材料與方法

1.1材料

青蛤采購于天津王頂?shù)毯ｕr品市場，暫養(yǎng)于密度1.02～1.04g/cm3的中性海水中，持續(xù)供氧，水溫22℃左右[7]，投喂5‰小球藻。飼喂大約7d，選取體表完好、個體形態(tài)差別較小的青蛤[平均殼寬（19.12±0.56）mm、平均殼長（29.13±1.22）mm、平均殼高（29.51±1.46）mm]進行分組試驗。

1.2方法

1.2.1材料處理。

在注射前選取若干青蛤，提取血淋巴、鰓、肝臟、閉殼肌、外套膜組織約50mg冷凍備用;配置濃度約為1μg/g的PolyI：C[8]。將余下青蛤隨機分為試驗組和對照組，每組設置3個平行。在試驗組青蛤的閉殼肌部位中注射PolyI：C50μL，在對照組青蛤中注射等量滅菌海水。分別在注射后的0、3、6、12、24、48、96h提取青蛤的血淋巴。準確稱取各組織50mg，冷凍于液氮中備用。

1.2.2青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建。

將提取的青蛤6個組織于液氮中研磨充分后，置于1mLTrizol中提取組織的總RNA。按照QIAGEN公司的OligotexmRNAKits法分離純化總RNA。用隨機引物逆轉(zhuǎn)錄法將純化后的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將得到的cDNA末端修飾、加尾等，用以制備整個文庫。采用Unigene編碼蛋白框ORF預測分析去冗余后的數(shù)據(jù)，再經(jīng)Blast分析后，從中篩選得到青蛤ERK基因類似序列。再利用篩選得到的青蛤ERK基因類似序列進行克隆，設計克隆時所用引物CsERK-F1、CsERK-R1（表1）。

1.2.3生物信息學分析。

基因克隆產(chǎn)物與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫進行BlastX（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）分析[9]，利用開放閱讀框（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線分析軟件分析其開放閱讀框，使用SignalP3.0分析該基因的信號肽序列，利用SMART（http：∥smart.embl-heidelberg.de/）預測結(jié)構(gòu)域，ProtParam工具在線預測此序列的分子量、分子式和等電點，使用ClustalW對氨基酸序列進行同源性分析和多重比對[10]。

1.2.4ERK基因在青蛤各組織內(nèi)的表達。

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