莊瑩，張淑紅，樊偉平，趙小芳，孫海燕，劉爽 ，張虎

（1. 江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院基礎醫(yī)學部生化教研室，江蘇 鹽城 224005；2. 佳木斯大學基礎醫(yī)學院生物教研室，黑龍江 佳木斯 154007；3. 江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院護理學院內科護理教研室，江蘇 鹽城 224005）

乳腺癌是較為常見的女性惡性腫瘤之一。據最新統(tǒng)計，中國每年乳腺癌發(fā)病數占世界總數的12.2%，每年因乳腺癌死亡的病例數占世界總數的9.6%，且發(fā)病率和新發(fā)病例數目前仍在增加［1］。隨著生活水平的提高，人們對預后的關注度也在提升。DEAH盒解旋酶16 （DEAH-box helicase 16，DHX16）是一種蛋白質編碼基因，與主要組織相容性抗原同樣定位于染色體6p21.3，此區(qū)域與腫瘤的發(fā)生和自身免疫疾病相關［2］。但是，DHX16在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展過程中的研究未見報道。本研究利用多組學高通量數據，分析DHX16在乳腺癌中的表達情況及表達變化相關因素，為乳腺癌臨床研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數據來源

通 過 癌 癥 基 因 組 學 分 析 網 站cBioPortal［3-4］（http：//www.cbioportal.org） 、癌癥芯片數據庫UALCAN［5］（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html） 、癌癥多組學數據平臺LinkedOmics［6］（http：//www.linkedomics.org），分析乳腺癌組織中DHX16基因表達變化、基因表達變化相關因素及其臨床意義。

1.2 數據分析方法

1.2.1 mRNA水平變化與基因甲基化相關性的研究方法：登錄cBioPortal首頁，選擇實時更新的TCGA浸潤性乳腺癌患者數據集，分析 DHX16 基因突變、拷貝數變化、mRNA水平變化以及 DHX16 高表達與患者預后的關系。分析 DHX16 mRNA水平變化時，選擇RNA測序，并選擇默認閾值“DHX16：EXP≥2 or DHX16：EXP≤-2”下載分析結果；進一步使用該網站分析 DHX16 高表達與患者預后的關系，mRNA水平變化與DHX16基因甲基化的相關性。

1.2.2 基因表達變化與癌癥分型相關性的研究方法：登錄TCGA門戶網站UALCAN首頁，點擊“Analysis”，輸入基因名稱“DHX16”，選擇TCGA dataset“Breast invasive carcinoma”，檢索，點擊“Expression”，記錄結果。利用GraphPad 6.0軟件作圖，統(tǒng)計方法為t檢驗，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.2.3 mRNA水平變化與基因拷貝數變化相關性的研究方法：登錄LinkedOmics首頁，癌癥組選擇“TCGA_BRCA”，檢索數據集選擇“HiSeq RNA”，輸入目標基因“DHX16”，目標數據集選擇“Clinical”，統(tǒng)計方法選擇“Non-parametric T test”，提交，在分析結果中選擇“P ＜ 0.05”的臨床相關指標進行分析；使用該網站分析DHX16 mRNA水平變化與DHX16基因拷貝數變化相關性。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料的比較采用t檢驗，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DHX16在乳腺癌患者中表達的變化及其與預后的關系

對1 093例乳腺癌患者樣本數據進行分析發(fā)現，12%的患者DHX16 mRNA表達上調 （圖1A） ；16%的患者DHX16基因發(fā)生改變，包括基因擴增、缺失、錯義突變、mRNA下調或上調 （圖1B） ；且DHX16高表達不利于乳腺癌預后 （P = 0.004） （圖1C） ；浸潤性乳腺癌中DHX16基因表達較正常乳腺組織顯著增加（P ＜ 0.001） （圖1D） 。

圖1 DHX16在乳腺癌患者中表達的變化及其與預后的關系Fig.1 Changes in DHX16 expression in breast cancer patients and its relationship with prognosis

2.2 乳腺癌患者中DHX16基因表達變化與臨床指標的相關性

乳腺癌患者中DHX16基因表達在不同PAM50分子亞型、種族、病理分期、M分期、T分期中表達有差異 （均P ＜ 0.05） 。見圖2。

2.3 DHX16基因拷貝數變化及甲基化影響其表達

圖2 DHX16基因表達與各臨床指標的關系Fig.2 Correlation between DHX16 gene expression and clinical findings

結果顯示，DHX16拷貝數變化和DHX16 mRNA水平呈正相關 （r = 0.56，P ＜ 0.05） （圖3A） ；DHX16基因甲基化水平和DHX16 mRNA水平呈負相關 （r =-0.32，P ＜ 0.05） （圖3B） 。

圖3 乳腺癌患者DHX16基因甲基化和拷貝數變化對mRNA水平的影響Fig.3 Effect of DNA methylation and copy number variation on DHX16 mRNA levels in breast cancer

3 討論

乳腺癌是中國女性患病率最高的惡性腫瘤之一，近年來確診人數一直在增加［7］。隨著乳腺癌診斷和治療水平不斷提高，患者的生存時間和生活質量得到了初步改善。由于其發(fā)病機制目前仍未完全揭示，因此預后改善程度難以滿足臨床需要［8］。本研究首次發(fā)現DHX16基因在乳腺癌組織中高表達，提示該分子參與乳腺癌發(fā)生與進展。本研究對其進行初步研究，為臨床乳腺癌預后提供新的思路。

DHX16屬于DEAD/H盒解旋酶家族［9］。該家族成員與多種惡性腫瘤及自身免疫性疾病相關［10］。DHX16具有ATP結合RNA解旋酶活性，參與細胞周期的進展和人類前體mRNA剪接過程［9］，DHX16的缺失可導致前體mRNA滯留在細胞核內，無法進行蛋白質翻譯［11］。另外有文獻［12］報道，DHX16通過影響mRNA剪接過程，在肺癌發(fā)展中起重要作用。本研究首次發(fā)現DHX16高表達不利于乳腺癌預后，其原因可能是DHX16高表達可調節(jié)癌基因前體mRNA的剪接、轉運出核并表達，促進乳腺癌的發(fā)生和進展，不利于乳腺癌預后。

對DHX16表達與臨床指標進行相關性分析，發(fā)現乳腺癌患者DHX16表達與PAM50不同分子亞型相關，Basal型乳腺癌患者的DHX16表達水平最高，其次是LumB型、Her2型和LumA型乳腺癌患者。乳腺癌患者DHX16表達受種族的影響，表達具有種族特異性。乳腺癌患者DHX16表達與乳腺癌病理分期相關，隨著分期增加表達上升，提示DHX16高表達可能促進乳腺癌進展。乳腺癌患者DHX16表達與乳腺癌M分期相關，遠處轉移M1期高于M0期，提示DHX16高表達可能促進乳腺癌轉移。乳腺癌患者DHX16表達與乳腺癌T分期相關，隨著腫瘤直徑增大表達上升，提示DHX16高表達可能與細胞增殖相關。

基因拷貝數增加通常會引起基因表達上升［13］，本研究發(fā)現DHX16表達水平與其基因拷貝變化正相關。異常的啟動子DNA過度甲基化通常是導致基因沉默的調節(jié)因素之一，有研究［14］報道DNA甲基化影響乳腺癌的基因表達譜，從而影響乳腺癌的分型，同時也被作為某些癌癥治療的靶點。本研究中，DHX16基因甲基化水平與其表達水平呈負相關，說明DNA低甲基化促進了DHX16的表達。

本研究運用多組學高通量數據庫分析乳腺癌患者樣本，基于數據庫數據大、隨訪時間長、組學數據完備，DHX16高表達不利于乳腺癌患者預后這一結果的可信度高，可作為乳腺癌預后的一個潛在標志物。但研究也存在一些不足，如分析結果受到樣本來源的限制。后續(xù)研究中，本課題組會在更多臨床乳腺癌患者樣本中驗證DHX16的表達差異，并進一步研究DHX16參與乳腺癌進展的分子機制。