朱夢(mèng)婷 吳 辰 陳 奕 謝明勇

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047）

食品乳狀液體系是許多食品體系不可缺少的組成部分，除了常規(guī)的奶油食品、色拉調(diào)味品、蛋白醬和肉類(lèi)乳狀液外，很多功能性物質(zhì)（如營(yíng)養(yǎng)素、香精、色素、抗菌劑、保健品等）也被制成O/W乳狀液，在食品中使用和穩(wěn)定儲(chǔ)存[1]。由于油脂的存在，所以乳狀液體系在儲(chǔ)藏過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)油脂氧化的問(wèn)題。油脂氧化會(huì)導(dǎo)致食品感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的下降，形成的一些氧化產(chǎn)物還會(huì)對(duì)人體造成極大危害，比如容易導(dǎo)致心血管疾病、癌癥等[2]。添加抗氧化劑是目前控制純油相體系中油脂氧化的常用方法。對(duì)于純油相體系中油脂氧化歷程已研究得比較清晰，且發(fā)現(xiàn)不同極性抗氧化劑在純油脂體系中，抗氧化劑極性越強(qiáng)，抗氧化活性則越強(qiáng)[3]。對(duì)乳狀液中油脂氧化的研究表明，油脂氧化后形成的過(guò)氧化物易于分布在乳狀液的油水界面膜中，從而導(dǎo)致乳狀液氧化穩(wěn)定性降低。非極性物質(zhì)可能更易于在油水界面上有一定的分布，因此在油脂乳化體系中非極性抗氧化劑應(yīng)該較極性抗氧化劑的活性要強(qiáng)，此規(guī)律與純油脂體系中恰好相反。這就是Porter 等[4]最早提出的“極性矛盾”（polar paradox hypothesis）學(xué)說(shuō)。

后來(lái)這一學(xué)說(shuō)相繼被Frankel 等[5]用來(lái)評(píng)價(jià)乳狀液體系中生育酚和維生素C 及其酯等抗氧化劑的作用，雖然這些研究似乎證實(shí)了抗氧化極性悖論，但最近的一些研究表明這一假說(shuō)并不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)所有不同極性抗氧化劑的抗氧化行為。比如Alemán，Laguerre 等[6-7]將迷迭香酸、羥基酪醇、脫羥基咖啡酸和蘆丁等通過(guò)與不同長(zhǎng)度的烷基鏈（1～20 個(gè)碳原子）進(jìn)行酯化合成后，測(cè)定它們?cè)谒腿橐褐械目寡趸钚裕鶕?jù)“極性矛盾”假說(shuō)，隨著烷基鏈的增長(zhǎng)，化合物的非極性增加，抗氧化活性應(yīng)該也會(huì)隨之增加，然而事實(shí)上當(dāng)烷基鏈長(zhǎng)超過(guò)一定程度后，抗氧化活性反而急劇下降。在水包油乳液體系中，抗氧化物質(zhì)的分布與其極性之間不一定呈現(xiàn)簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。作者推測(cè)，當(dāng)上述這些物質(zhì)的烷基鏈增加到一定程度后，有可能會(huì)產(chǎn)生一定的疏水性，從而使其更易分布于油相而不是界面膜。另外，非極性很強(qiáng)的化合物也很容易和乳狀液中的乳化劑結(jié)合形成膠束，影響它在乳液中的分布。為了對(duì)上述假想進(jìn)行驗(yàn)證，有必要對(duì)不同極性抗氧化物質(zhì)在乳狀液中的抗氧化性能和其分布的關(guān)系進(jìn)行研究。

沒(méi)食子酸（Gallic acid）是一種天然酚類(lèi)抗氧化劑，已應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日用化工等行業(yè)中，然而，其易溶于水、難溶于油的特性限制了它在乳狀液氧化抑制中的應(yīng)用。將它與脂肪醇酯化后，可提高分子的脂溶性，且烷烴鏈越長(zhǎng)，烷基酯脂溶性越好。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于沒(méi)食子酸及其烷基酯對(duì)乳狀液氧化穩(wěn)定性影響的相關(guān)研究甚少[8]。本文以不同極性沒(méi)食子酸酯為研究對(duì)象，通過(guò)比較它們對(duì)水包油型乳狀液的物理和氧化穩(wěn)定性的影響，并結(jié)合它們?cè)谒嗪徒缑婺ぶ械姆植?，探討沒(méi)食子酸及其酯類(lèi)化合物在乳狀液中的抗氧化作用和其分布的關(guān)系。本研究結(jié)果可為提高乳狀液體系氧化穩(wěn)定性提供重要的試驗(yàn)依據(jù)與理論指導(dǎo)，同時(shí)也能拓展沒(méi)食子酸酯的應(yīng)用領(lǐng)域，為綜合開(kāi)發(fā)、合理利用這一天然資源奠定理論基礎(chǔ)，為乳狀液氧化穩(wěn)定性研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米油（試劑級(jí)、不含抗氧化劑），上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸丙酯、沒(méi)食子酸辛酯、 沒(méi)食子酸月桂酯、 沒(méi)食子酸十八酯，上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；吐溫 20、NaN3、十二烷基硫酸鈉、尼羅紅、D-α-生育酚（≥96%分析純）、三氟化硼乙醚絡(luò)合物、亞硝酸叔丁酯，上海阿拉丁試劑有限公司；十六烷基苯胺、己醛（≥99%），美國(guó)sigma 公司；甲醇（色譜級(jí)），德國(guó)Meker 公司；硫氰酸鉀、氯化鋇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、七水硫酸亞鐵、異辛烷、異丙醇、乙醚、丙酮，上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultra Turrax T 25 型高速分散機(jī)，德國(guó)IKA公司；GYB 30-6S 高壓均質(zhì)機(jī)，上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；Nano-ZS90 納米粒徑電位分析儀，英國(guó)馬爾文公司；TU-1900 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；Agilent 7890A/7000 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 1260 高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)安捷倫公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳狀液的制備 先配制10 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）：分別稱(chēng)取8 g NaCl、0.2 g KCl、1.38 g Na2HPO4和0.2 g KH2PO4，用去離子水溶解定容至1 L。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的Tween 20 溶解于PBS 緩沖液中配制成乳狀液的水相溶液。將玉米油從冰箱取出，待其溶解后取1%玉米油和99%水相溶液用分散機(jī)攪拌2 min，再將乳狀液用高壓均質(zhì)機(jī)在40 MPa 均質(zhì)2 次，得到的乳狀液加入NaN3（0.02%，w/w）作為抑菌劑。1%玉米油和99% 水相溶液用高速分散機(jī)攪拌2 min，再用高壓均質(zhì)機(jī)（40 MPa）均質(zhì)2 次得到乳狀液，加入0.02% NaN3作為抑菌劑。

1.3.2 抗氧化劑對(duì)乳狀液顆粒性質(zhì)的影響 按照1.3.1 節(jié)的方法制備乳狀液，在制備好的乳狀液中分別加入30，60 和90 μmol/L 的沒(méi)食子酸及其酯類(lèi)化合物（R3、R8、R12 和R18）和α-生育酚（TOH）甲醇溶液，攪拌1 h 使其混合均勻，避光保存，定期測(cè)定乳狀液顆粒粒徑和ζ-電位。測(cè)定方法參考Ramírez-Suárez 等[9]的方法：用馬爾文Nano-ZS90 納米粒徑電位分析儀分別測(cè)定乳狀液的粒徑和ζ-電位。為了降低多重光散射效應(yīng)，分析前用蒸餾水將乳狀液稀釋100 倍。

1.3.3 抗氧化劑對(duì)乳狀液氧化穩(wěn)定性的影響 按照1.3.1 節(jié)的方法制備乳狀液，在制備好的乳狀液中分別加入30 μmol/L 的沒(méi)食子酸及其酯類(lèi)化合物甲醇溶液，攪拌1 h 使其混合均勻，取5 mL 轉(zhuǎn)移至20 mL 頂空瓶中，用聚四氟乙烯隔墊密封在25 ℃暗處保存，定期測(cè)定乳狀液的過(guò)氧化值和己醛含量。

1.3.3.1 可見(jiàn)分光光度法測(cè)定乳狀液的過(guò)氧化值[10]

Fe2+儲(chǔ)備液：1 體積0.132 mol/L BaCl 和1 體積0.144 mol/L FeSO4·7H2O 混合，離心取上清液；Fe3+標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：4.9769 g FeSO4·7H2O 溶于 50 mL去離子水中，加入100 mL 濃H2SO4，加溫溶解后滴入20% KMnO4溶液，直至溶液紅色褪色且保持30 s 不變，定容至1 000 mL，搖勻，儲(chǔ)備液每毫升含100 μg Fe3+；Fe3+標(biāo)準(zhǔn)工作液：取10 mL Fe3+標(biāo)準(zhǔn)貯備液于100 mL 容量瓶中，用甲醇∶正丁醇（2∶1，V/V）混合液定容，混勻靜置得標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，工作液每毫升含10 μg Fe3+。

Fe3+標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：分別移取0，10，20，40，80，100，200，400 μL 的Fe3+標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于10 mL 試管中，分別加入20 μL 3.94 mol/L 硫氰酸鉀溶液，用甲醇∶正丁醇（2∶1，V/V）混合溶液定容至5 mL。渦旋混合10s，室溫避光靜置20 min，甲醇正丁醇混合液作為空白對(duì)照，在510 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。重復(fù)3 次測(cè)定，以吸光度平均值對(duì)相應(yīng)Fe3+的含量（μg）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

乳狀液的過(guò)氧化值的測(cè)定：從頂空瓶中取1 mL 乳狀液到試管中，加入5 mL 異辛烷∶異丙醇（2∶1，V/V）混合溶液，渦旋混合，再以5 000 r/min離心5 min。取1 mL 上清液，加入20 μL 硫氰酸鉀和氯化亞鐵溶液，再用甲醇∶正丁醇（2∶1，V/V）混合溶液定容至5 mL，渦旋混合10s，室溫下避光靜置20 min，以甲醇正丁醇混合溶液作空白對(duì)照，在510 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。

過(guò)氧化值計(jì)算公式：POV=（A×n×0.5 × K）/（55.86×m×2）×1 000

式中：POV——樣品的過(guò)氧化值，meq/kg；A——測(cè)得樣品液的吸光度；K——測(cè)得Fe3+標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率；55.86——Fe 的原子量；m——樣品中油脂的質(zhì)量，g；0.5——O/Fe 的物質(zhì)的量比；n——吸取上清液的體積分?jǐn)?shù)；2——氧換算為過(guò)氧化值的系數(shù)。計(jì)算結(jié)果精確至0.01。

1.3.3.2 頂空進(jìn)樣-GC-MS 法測(cè)定乳狀液的己醛含量[11]己醛標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：配制含0.001 mol己醛的標(biāo)準(zhǔn)液，分別稀釋成含己醛0.002，0.005，0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 μmol 的梯度標(biāo)準(zhǔn)液，以己醛濃度為橫坐標(biāo)，己醛峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

頂空進(jìn)樣條件：爐溫65 ℃；定量環(huán)溫度110℃；傳輸線(xiàn)溫度130 ℃；GC 平衡時(shí)間13 min；進(jìn)樣瓶加熱平衡時(shí)間10 min；頂空瓶瓶?jī)?nèi)壓10 psi；瓶加壓時(shí)間0.5min；填充定量環(huán)時(shí)間0.5 min；定量環(huán)平衡時(shí)間0.5 min；進(jìn)樣時(shí)間1 min。

GC-MS 工作條件：色譜柱：Agilent HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）；分流比：7∶1；流速1 mL/min；柱溫65 ℃；傳輸線(xiàn)溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃。

1.3.4 抗氧化劑在乳狀液中的分布[12]

1.3.4.1 抗氧化劑在水相中的分布 沒(méi)食子酸及其烷基酯和α-生育酚紫外最大吸收波長(zhǎng)的確定：稱(chēng)取沒(méi)食子酸及其烷基酯和α-生育酚各標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成濃度為100 μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以甲醇為空白對(duì)照，在200～500 nm 范圍內(nèi)紫外掃描，得到紫外吸收曲線(xiàn)。

沒(méi)食子酸及其烷基酯和α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：將100 μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋得到梯度濃度為5，20，40，50，60，80，100 μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)液，過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜，進(jìn)液相測(cè)定得各濃度對(duì)應(yīng)的峰面積，以濃度梯度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

樣品測(cè)定：分別取適量含100 μmol/L 沒(méi)食子酸及其烷基酯和α-生育酚的乳狀液于試管中，加入200 μmol/L EDTA 溶液以降低試驗(yàn)過(guò)程中乳狀液的氧化，4 ℃下15 000 r/min 高速離心1 h，取下層乳清再次離心30 min，小心吸取下層水液，合并兩次水液過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜，待測(cè)。

液相色譜條件：色譜柱：Hypersil ODS2-C18（250 μm×4.6 μm×5 μm）；流動(dòng)相A：甲醇，B：3 mmol/L 磷酸水溶液；R0、R3、R8 和R12 梯度洗脫條件：0 min 5%甲醇，15 min 100%甲醇，20～25 min 5%甲醇；R18 和TOH 梯度洗脫條件：0 min 20%甲醇，15～30 min 100%甲醇，40～45 min 20%甲醇。

1.3.4.2 抗氧化劑在界面層的分布 界面層中抗氧化劑測(cè)定引用一種化學(xué)探針——十六烷基重氮苯離子16-ArN2+，由十六烷基苯胺重氮化得到的兩親性物質(zhì)，其合成方法參照Doyle 等[13]的研究。

由于不能將乳狀液三相完全分離，為測(cè)定沒(méi)食子酸及其烷基酯和α-生育酚在乳狀液界面層中的分布情況，只能采用間接手段來(lái)測(cè)定。在乳狀液界面層中，16-ArN2+與抗氧化劑的反應(yīng)速率能間接反映抗氧化劑在界面層的分布情況，NED 與16-ArN2+結(jié)合能產(chǎn)生一種偶氮染料，偶氮染料在572 nm 下其含量與吸光度值呈正相關(guān)關(guān)系，因此，只要在反應(yīng)液中加入過(guò)量的NED 溶液，16-ArN2+與抗氧化劑的反應(yīng)速率Kobs，可用16-ArN2+在反應(yīng)過(guò)程中含量衰減量（即吸光度值衰減值）隨時(shí)間變化所做曲線(xiàn)的斜率來(lái)表示。

試驗(yàn)過(guò)程參照Sánchezpaz 等[12]的方法，按照

1.3.1 節(jié)的方法制備乳狀液，取1 mL 現(xiàn)配的乳液于2 mL EP 管中，分別取20 μL 濃度30 mmol/L的沒(méi)食子酸及其烷基酯和α-生育酚標(biāo)液加入乳液中，渦旋1 min，超聲處理30 min 得到含抗氧化劑的乳液；10 μL 濃度0.017 mol/L 的16-ArN2+乙腈溶液與30 μL 含抗氧化劑的乳液混合得40 μL混合物，再與1 mL 濃度0.01 mol/L 的NED 乙醇溶液混合反應(yīng)，每隔1 min 測(cè)定反應(yīng)液在572 nm的吸光度值，直至吸光度值不變?yōu)橹?；根?jù)吸光度值隨時(shí)間的變化得到二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)Kobs。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)經(jīng)過(guò)至少3 次重復(fù)（n≥3），試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)用Origin 8.0 進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗氧化劑對(duì)乳狀液顆粒性質(zhì)的影響

2.1.1 不同抗氧化劑對(duì)乳狀液顆粒性質(zhì)的影響沒(méi)食子酸及其烷基酯和α-生育酚作為抗氧化劑以30 μmol/L 的濃度加入乳液中，乳狀液在30 d內(nèi)的粒徑和ζ-電位變化見(jiàn)圖1。由圖1a可知，未添加抗氧化劑的乳狀液粒徑約300 nm，添加抗氧化劑的乳液粒徑大小都在250 nm 左右，可見(jiàn)添加抗氧化劑使得乳狀液分散更加均勻，此結(jié)果與Atarés 等[14]的報(bào)道一致。添加等濃度的R0、R3、R8、R12、R18 和TOH 的乳狀液粒徑在30 d 內(nèi)較穩(wěn)定，說(shuō)明等濃度沒(méi)食子酸及其烷基酯和α-生育酚對(duì)乳液粒徑?jīng)]有產(chǎn)生差異性的影響，這與Luo等[15]測(cè)定的銀椴苷、蘆丁和柚皮苷3 種黃酮類(lèi)抗氧化劑對(duì)乳狀液粒徑作用效果不同，這可能是因?yàn)辄S酮類(lèi)物質(zhì)間的乳化能力差別大且粒徑（8～35 μmol/L）遠(yuǎn)大于用Tween20 配制的乳液。

圖1b為添加等濃度的沒(méi)食子酸及其烷基酯和α-生育酚的乳液在30 d 內(nèi)的ζ-電位，未添加抗氧化劑的乳液ζ-電位約-45mV，不同抗氧化劑對(duì)乳狀液ζ-電位產(chǎn)生的影響不同。在添加30 μmol/L R0，R3，R8 和α-生育酚的條件下，乳液的ζ-電位降低至-20 mV 左右，而添加30 μmol/L R12 和R18，ζ-電位與未添加前相差不大。R0，R3和R8 的水溶性較好，α-生育酚幾乎不溶于水，而R12 和R18 的脂溶性較大，說(shuō)明ζ-電位的變化可能與各抗氧化劑的水溶性強(qiáng)弱相關(guān)，沒(méi)食子酸及其烷基酯和α-生育酚在乳液微環(huán)境中的分布對(duì)油滴表面電荷產(chǎn)生了影響。Shao 等[16]在大豆蛋白穩(wěn)定的乳液相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)離子強(qiáng)度和pH 等因素對(duì)乳液油滴表面電荷會(huì)產(chǎn)生影響繼而改變?nèi)橐害?電位。

圖1 抗氧化劑對(duì)乳狀液粒徑（a）和ζ-電位（b）的影響Fig.1 Effects of antioxidants on particle size （a）and ζ - potential （b）of emulsion

2.1.2 抗氧化劑濃度對(duì)乳狀液顆粒性質(zhì)的影響在玉米油水包油乳狀液（Tween 20，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%）中加入濃度分別為30，60 和90 μmol/L 的沒(méi)食子酸月桂酯和α-生育酚甲醇溶液，30 d 內(nèi)乳狀液中顆粒粒徑和ζ-電位變化情況見(jiàn)圖2，數(shù)據(jù)表明這些乳液的顆粒粒徑約250 nm 且在30 d 內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，ζ-電位隨著沒(méi)食子酸月桂酯和α-生育酚的濃度增加而遞減，表明乳狀液液滴所帶負(fù)電荷減少了，類(lèi)似的結(jié)果有其他研究報(bào)道[17-19]。

圖2 抗氧化劑濃度對(duì)乳狀液粒徑（a）和ζ-電位（b）的影響Fig.2 Effect of antioxidant concentration on particle Size （a）and ζ - potential （b）of emulsion

2.2 沒(méi)食子酸及其烷基酯對(duì)乳液氧化穩(wěn)定性的影響

試驗(yàn)以過(guò)氧化物值 （POV）和己醛為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察了抗氧化劑對(duì)玉米油O/W 乳狀液氧化穩(wěn)定性的影響。選擇測(cè)定過(guò)氧化物值（POV）和己醛是因?yàn)檫@兩種方法測(cè)定得到的結(jié)果分別反映了油脂氧化的初級(jí)產(chǎn)物和次級(jí)產(chǎn)物含量，同時(shí)使用這兩種指標(biāo)可以較為可靠地反映油脂氧化的程度。以Fe3+含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制POV 測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程為y =0.78912x-0.02376，相關(guān)系數(shù)R2=0.99649，根據(jù)每天測(cè)得的吸光度值帶入公式計(jì)算即可得到樣品的過(guò)氧化值POV。以己醛濃度（μmol）為橫坐標(biāo)，其峰面積為縱坐標(biāo)繪制己醛測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程y=4.0567×107x+22 015，相關(guān)系數(shù)R2=0.99898。

圖3顯示的是，添加30 μmol/L 沒(méi)食子酸及其烷基酯乳狀液的POV 值和己醛含量隨著氧化天數(shù)的變化情況，與空白組對(duì)照，沒(méi)食子酸及其烷基酯都提高了乳狀液的氧化穩(wěn)定性，比較乳狀液氧化過(guò)程中氫過(guò)氧化物和己醛的生成滯后時(shí)間長(zhǎng)短，得出抗氧化強(qiáng)弱順序?yàn)椋篟3＞R12＞R8＞R0＞R18。R3、R12 和R8 的抗氧化性強(qiáng)于R0，表明抗氧化劑非極性越強(qiáng)其在乳狀液中抗氧化性越強(qiáng)。這與“極性矛盾學(xué)說(shuō)”是一致的。但是，R3 抗氧化性強(qiáng)于R8，R12 和R18，R18 非極性最大但在乳液中的抗氧化性卻最弱，這種現(xiàn)象與“極性矛盾學(xué)說(shuō)”相違背，F(xiàn)erguson 和Balgavy 等[20-21]將這種現(xiàn)象命名為“cut-off effect”，是生物細(xì)胞毒性研究中較普遍的一種生物學(xué)現(xiàn)象，但是，抗氧化劑在乳狀液中抗氧化研究是初次涉及該理論。綠原酸，咖啡酸，迷迭香酸和沒(méi)食子酸等酚酸及其烷基酯在乳狀液中的抗氧化研究已有報(bào)道類(lèi)似的試驗(yàn)結(jié)果[6-7，22-25]，說(shuō)明抗氧化劑在乳狀液中的抗氧化活性不僅與其極性相關(guān)，還與其他因素，比如抗氧化劑在乳液中的分布及疏水性強(qiáng)弱等因素相關(guān)。

2.3 沒(méi)食子酸及其烷基酯和α-生育酚在乳狀液中的分布測(cè)定

2.3.1 抗氧化劑在乳狀液水相中的分布 沒(méi)食子酸酯及α-生育酚的紫外掃描最大吸收比波長(zhǎng)分別為，沒(méi)食子酸270 nm，沒(méi)食子酸丙酯，辛酯，月桂酯和十八酯280 nm，α-生育酚295 nm，最終采用這幾個(gè)波長(zhǎng)應(yīng)用于HPLC 的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。

在相應(yīng)的色譜條件下，根據(jù)沒(méi)食子酸及其烷基酯與α-生育酚的濃度與色譜圖峰面積關(guān)系，作圖得出了各抗氧化劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，如圖4，各標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程的相關(guān)性都很好，R2介于0.960～0.998。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程和添加各抗氧化劑后乳狀液的色譜圖的峰面積，計(jì)算得出添加100 μmol/L 沒(méi)食子酸及其烷基酯乳狀液水相中各抗氧化劑的含量，如圖5所示，各抗氧化劑含量分別為R0：94.9735 μmol/L，R3：18.669 μmol/L，R8：19.485 μmol/L，R12：27.356 μmol/L，R18：2.9285 μmol/L，α -生育酚：0.1384 μmol/L。可見(jiàn)，沒(méi)食子酸90%以上分布在水相中，與乳狀液油滴接觸概率最小，在乳狀液界面層分布自然也特別少，在乳狀液中抗氧化活性較弱。沒(méi)食子酸丙酯，辛酯，月桂酯在水相中含量約20%～30%，主要分布在油滴內(nèi)部或界面層，在乳液中有較強(qiáng)的抗氧化活性。沒(méi)食子酸十八酯在水相中含量特別低約3%，但是抗氧化活性最弱，Panya 等有類(lèi)似研究的報(bào)道，他們猜想迷迭香酸二十酯在乳狀液中發(fā)生自我凝聚，形成水溶性差的聚合物或與Tween20 形成膠束結(jié)構(gòu)，因此在水相中含量低且抗氧化活性較弱。

圖3 不同極性沒(méi)食子酸酯對(duì)乳狀液過(guò)氧化值（a）和己醛（b）的影響Fig.3 Effects of different polar gallic acid esters on the peroxide value （a）and hexanal （b）of the emulsion

圖4 沒(méi)食子酸及其烷基酯與α-生育酚的HPLC 測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 Calibration curves for gallic acid esters and α-tocopherol with HPLC

圖5 沒(méi)食子酸酯與α-生育酚在乳狀液水相中的分布Fig.5 Distribution of gallate and α-tocopherol in aqueous phase of emulsion

2.3.2 抗氧化劑在乳狀液界面層中的分布 參照Doyle 等[13]的研究方法，首先制備獲得十六烷基重氮苯離子16-ArN2+化合物，為了驗(yàn)證制備是否成功，采用KBr 壓片法，測(cè)得十六烷基苯胺及合成產(chǎn)物的紅外掃描結(jié)果見(jiàn)圖6，從圖譜（a）可知十六烷基苯胺的特征譜峰歸屬如下：波長(zhǎng)3 372.2 cm-1處為-NH 伸縮振動(dòng)的特征吸收峰；1 626.1 cm-1處，為-NH 的彎曲振動(dòng)特征吸收峰；1 466.9，1 518.09處為苯環(huán)中C=C 伸縮振動(dòng)特征吸收峰；723.6 cm-1處為-（CH2）n-指紋區(qū)特征吸收峰。對(duì)比十六烷基苯胺及合成產(chǎn)物的紅外圖譜發(fā)現(xiàn)，合成產(chǎn)物在波長(zhǎng)2 262.8～2 561.4 cm-1這一區(qū)域明顯增添了好幾個(gè)吸收峰，即為重氮化合物C-N=N 和N=N 伸縮振動(dòng)特征吸收峰。因此，由紅外光譜初步確定合成產(chǎn)物中含有N=N 的重氮化結(jié)構(gòu)。

圖6 十六烷基苯胺（a）及合成產(chǎn)物（b）的紅外圖譜Fig.6 FTIR spectra of hexadecylaniline（a）and 16-ArN2+（b）

由于探針離子16ArN2+化合物結(jié)構(gòu)十分獨(dú)特，它既是油不溶性（由于含有陽(yáng)離子基團(tuán)），同時(shí)又是水不溶性（十六烷基烴鏈的結(jié)果）化合物，這意味著它和抗氧化物質(zhì)的反應(yīng)只會(huì)在位于乳液界面膜區(qū)域發(fā)生。因此參照Sánchezpaz 等的方法，乳狀液界面層中抗氧化劑的分布測(cè)定可通過(guò)測(cè)定其在界面層中與探針離子16ArN2+的化學(xué)反應(yīng)速率來(lái)實(shí)現(xiàn)。表1列出了30 μmol/L 沒(méi)食子酸及其烷基酯和α-生育酚與170 μmol/L 的16ArN2+在界面層的化學(xué)反應(yīng)速率。沒(méi)食子酸丙酯二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)381M-1s-1最大，與其他烷基酯相比大小順序?yàn)椋篟3＞R12＞R8＞R18＞R0。

如圖7所示，沒(méi)食子酸丙酯在乳液中抗氧化活性最強(qiáng)，且其他烷基酯在乳液中的抗氧化活性強(qiáng)弱與二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)大小順序相關(guān)，即抗氧化劑的二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)越大，在乳狀液界面層的分布越多，在乳狀液中的抗氧化活性越強(qiáng)，可見(jiàn)，沒(méi)食子酸及其烷基酯和α-生育酚在乳狀液中的抗氧化活性與其在乳狀液界面層中的分布緊密相關(guān)。此研究結(jié)果與Losada 等[26]的報(bào)道一致，對(duì)乳狀液中油脂氧化的研究表明，油脂氧化后形成的過(guò)氧化物易于分布在乳狀液的油水界面膜中，分布在乳狀液界面上的脂過(guò)氧化物和水相中過(guò)渡金屬離子的相互作用是導(dǎo)致乳狀液氧化穩(wěn)定性降低的重要原因，因此，理想情況下，若自由基清除劑分布在油脂氧化自由基生成的部位，其抗氧化效率則最高。

圖7 玉米油乳狀液的氧化穩(wěn)定性的變化（氫過(guò)氧化物和己醛的生成滯后時(shí)間）與乳液界面層中抗氧化劑分布的相關(guān)性Fig.7 Correlation between the variation in the oxidative stability of corn emulsions （expressed as the lag time of hydroperoxide and hexanal）and the distribution of antioxidants in the interfacial region of the emulsions

表1 抗氧化劑與16-ArN2+在乳狀液界面層中的反應(yīng)速率常數(shù)KobsTable 1 Reaction rate constant for antioxidants and 16-ArN2+ in the emulsion interfacial layer Kobs

3 結(jié)論

不同抗氧化劑對(duì)乳狀液中的物理穩(wěn)定性的影響主要與其疏水性大小以及添加濃度有關(guān)。而不同極性抗氧化劑在乳狀液中的抗氧化活性不僅與其極性相關(guān)，還與其在乳狀液中的分布有關(guān)?？寡趸瘎┰谌闋钜核嗟暮靠砷g接反映其抗氧化活性，但在界面層中的含量與其在乳液中的抗氧化活性強(qiáng)弱呈正相關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外在水包油型乳狀液體系中抗氧化物質(zhì)的研究多局限于不同來(lái)源抗氧化活性物質(zhì)的單純應(yīng)用，而對(duì)不同抗氧化物質(zhì)之間的協(xié)同作用機(jī)制的研究不多。因此，就食品體系中抗氧化劑的作用機(jī)制，不僅要研究單一抗氧化劑的促/抗氧化機(jī)制，也要對(duì)復(fù)合抗氧化劑的相互作用機(jī)制進(jìn)行深入的研究，以找到一個(gè)有效的控制乳狀液體系氧化的方法，這對(duì)于促進(jìn)乳狀液的抗氧化機(jī)制研究也有一定的借鑒意義，同時(shí)對(duì)促進(jìn)乳狀液體系在各領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的理論參考價(jià)值和實(shí)際意義。