劉聯(lián)盟，梁 軍，呂鳳霞，李靈娟，馮文麗

(1.河南牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司，河南鄭州451162 ； 2.鄭州市獸藥飼料監(jiān)察所，河南鄭州450000)

替米考星是一種動(dòng)物專用大環(huán)內(nèi)酯類(MALs)抗生素，抗菌譜較廣，對革蘭陽性菌和部分陰性菌、支原體等均有效，具有較強(qiáng)的抗菌活性，主要用于牛、奶牛、山羊、綿羊、豬、雞等動(dòng)物由敏感菌引起的感染性疾病，特別是畜禽呼吸道疾病，如豬放線桿菌性胸膜肺炎、牛溶血性及多殺性巴氏桿菌病和雞支原體病，同時(shí)對奶牛乳房炎主要菌系具有良好的抗菌作用[1]。不合理的使用藥物不僅對動(dòng)物本身造成一定的影響，藥物在動(dòng)物性食品中的殘留還會(huì)進(jìn)一步對人類的健康造成潛在的威脅。為加強(qiáng)獸藥殘留監(jiān)控工作，保證動(dòng)物性食品衛(wèi)生安全，維護(hù)人體健康，我國農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布了第235號公告[2]，對動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量和殘留標(biāo)示物進(jìn)行了規(guī)定，其中替米考星的組織殘留標(biāo)示物為其原型，雞肌肉、皮脂、肝臟和腎臟組織中替米考星最高殘留分別為75、75、1 000 μg/kg和250 μg/kg。

農(nóng)業(yè)部第1025號公告[3]中，發(fā)布了動(dòng)物性食品中替米考星殘留檢測高效液相色譜法，該方法僅適用于豬肌肉和肝臟、雞肌肉和肝臟組織中替米考星的殘留檢測，而雞可食性組織中皮脂和腎臟組織中替米考星殘留檢測方法未發(fā)布國家標(biāo)準(zhǔn)，且目前國內(nèi)未發(fā)現(xiàn)雞皮脂和腎臟組織中替米考星殘留檢測方法的報(bào)道，其他動(dòng)物性食品中替米考星殘留的測定方法主要有高效液相色譜法[4-7]、質(zhì)譜法[8-10]等，其中前者儀器操作簡單、普及面廣，是最常用的替米考星檢測方法。為完善健全雞可食性組織中替米考星殘留檢測方法，便于獸藥殘留監(jiān)控，保證食品衛(wèi)生安全，本試驗(yàn)建立了雞腎臟和皮脂組織中替米考星殘留的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與試劑

1.1.1 主要設(shè)備 Agilent1200高效液相色譜儀，配VWD紫外檢測器，Agilent公司；N-EVAP34氮吹儀，Organomation Assciates公司；3-30k型高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；XP205電子分析天平，感量0.00 001 g，METTLER TOLEDO公司。

1.1.2 主要試劑 替米考星對照品，含量95.0%，批號C17582000，Dr. Ehrenstorfer公司；MCX SPE固相萃取柱，6 CC(150 mg)，Waters公司；甲醇、乙腈、四氫呋喃均為色譜純，Merck公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要試液配制

1.2.1 二丁胺磷酸緩沖液 取10%磷酸溶液700 mL，緩緩加入168 mL二丁胺，邊加邊攪拌。冷卻至室溫，用85%磷酸調(diào)pH值至2.5，加水稀釋至1 000 mL。注意該試液變成棕色時(shí)不能使用。

1.2.2 pH值5.0磷酸鹽緩沖液 量取0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液一定量，用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至5.0，即得。

1.2.3 洗脫液 量取5 mL氨水，加至95 mL甲醇中，混勻。

1.2.4 流動(dòng)相 分別量取115 mL乙腈、55 mL四氫呋喃、25 mL二丁胺磷酸緩沖液，依次加入805 mL水中，稀釋至1 000 mL，混合均勻，0.2 μm濾膜過濾。配制前各組分要真空脫氣。使用時(shí)密封，以防止流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑揮發(fā)。

1.2.5 替米考星儲備液 精密稱取替米考星對照品約21.05 mg置于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得200 μg/mL的替米考星儲備液。4 ℃下避光保存。

1.2.6 替米考星工作液 精密量取200 μg/mL替米考星儲備液5 mL置于100 mL棕色容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋并定容。4 ℃下避光保存。

1.3 色譜工作條件 流動(dòng)相：乙腈-四氫呋喃-1 mol/L二丁胺磷酸緩沖液-水(115/55/25/805，v/v/v)；色譜柱：Agilent HC-C18(2)(250×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：50 μL。

1.4 標(biāo)曲建立 量取適量10 μg/mL替米考星標(biāo)準(zhǔn)工作液于容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋并定容，制成濃度為0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次進(jìn)樣，以替米考星濃度為橫坐標(biāo)，以其峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5 樣品前處理

1.5.1 提取 稱取(5.0 ± 0.05)g試樣于50 mL離心管中，加8 mL乙腈，渦動(dòng)混勻，中速振蕩30 min，9 000 r/min離心10 min，取上清液(其中皮脂樣品乙腈、脂肪分層，取全部乙腈，下同)于50 mL離心管中，組織殘?jiān)性偌? mL乙腈，超聲破碎，渦動(dòng)混勻，中速振蕩30 min，9 000 r/ min離心10 min，合并兩次上清液。將上清液50 ℃水浴氮?dú)獯抵?～2 mL，依次加入8 mL流動(dòng)相、1 mL正己烷，渦旋5 min，9 000 r/min離心10 min，取全部中間清液記為A液。殘?jiān)? mL pH值5.0磷酸鹽緩沖液，渦旋5 min，9 000 r/min離心10 min，取全部中間清液記為B液。

1.5.2 凈化 取MCX(6 CC/150 mg)小柱，依次用10 mL甲醇、2 mL pH值5.0磷酸鹽緩沖液平衡，依次將上述A液和B液全部過柱。再用10 mL水和5 mL甲醇洗滌，抽真空干燥1 min，用4 mL洗脫液洗脫。收集洗脫液，50 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?。? mL流動(dòng)相，渦動(dòng)2 min溶解，過濾，供HPLC分析。固相萃取過柱、洗滌液和洗脫液流速均不超過1 mL/min。

1.6 靈敏度 取雞空白皮脂和腎臟組織試樣添加適量濃度的替米考星標(biāo)準(zhǔn)工作液，各5個(gè)平行，按樣品前處理方法處理后測定。取信噪比S/N≥3時(shí)的濃度為檢測限(LOD)，信噪比S/N≥10時(shí)，且準(zhǔn)確度與精密度符合要求的濃度為定量限(LOQ)。

1.7 準(zhǔn)確度和精密度 皮脂組織添加替米考星在35、75 μg/kg和150 μg/kg三個(gè)濃度水平，腎臟組織添加替米考星在50、250 μg/kg和500 μg/kg三個(gè)濃度水平，進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度考察試驗(yàn)，按樣品前處理方法處理后測定。每批每種組織的各個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行樣品，連續(xù)3 d，共作3個(gè)批次，以此分別計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.1～5.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，藥物濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=76.188X+3.576 6 (R2=0.999 9)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 替米考星線性關(guān)系

2.2 色譜行為 替米考星對照品、皮脂及腎臟空白組織、皮脂及腎臟空白組織分別添加替米考星的色譜圖見圖2。在本試驗(yàn)建立的色譜條件下，待測組分替米考星與溶劑峰及組織中其他基質(zhì)組分能夠完全分開，不干擾結(jié)果的測定。

2.3 結(jié)果計(jì)算 雞皮脂和腎臟中替米考星的殘留量計(jì)算采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程進(jìn)行計(jì)算，在試樣測定前應(yīng)使用替米考星標(biāo)準(zhǔn)工作液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。若測定試樣溶液中替米考星濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍，應(yīng)將樣品濃度定量稀釋或濃度。

圖2 雞皮脂和腎臟中添加替米考星色譜圖

a:0.5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液 ； b:皮脂空白樣品 ； c:75 μg/kg皮脂添加樣品 ； d:腎臟空白樣品 ； e:125 μg/kg腎臟添加樣品

2.3.1 殘留量的計(jì)算 替米考星組織中殘留的量X，按下式計(jì)算：

式中：C為試樣溶液中對應(yīng)的替米考星的濃度(μg/mL)；V為溶解殘余物所用流動(dòng)相的體積(mL)；m為試樣的重量(g)。

2.3.2 回收率的計(jì)算 替米考星添加回收率，按下式計(jì)算：

式中：X實(shí)測為空白組織添加替米考星的實(shí)測殘留量；X添加為空白組織實(shí)際添加替米考星。

2.4 靈敏度 由雞皮脂和腎臟組織中添加替米考星考察得，本方法替米考星在雞皮脂組織中的檢測限為20 μg/kg，定量限為35 μg/kg；在雞腎臟組織中的檢測限為30 μg/kg，定量限為50 μg/kg。

2.5 準(zhǔn)確度和精密度 樣品添加回收率測定結(jié)果見表1，批內(nèi)及批間精密度測定結(jié)果見表2。雞皮脂組織的回收率在75%～98%之間，批內(nèi)與批間變異系數(shù)均小于10%；雞腎臟組織的回收率在71%～97%之間，批內(nèi)變異系數(shù)小于11%，批間變異系數(shù)小于10%。表明該方法準(zhǔn)確度、精密度高，重復(fù)性好。

表1 雞皮脂和腎臟中添加替米考星回收率 (%，n=5)

表2 雞皮脂和腎臟中添加替米考星批內(nèi)與批間變異系數(shù)

3 討論

3.1 色譜條件 替米考星是MALs類抗生素的一種，有較強(qiáng)的紫外吸收，HPLC法配紫外檢測器是對其進(jìn)行殘留檢測的主要方法。反相色譜柱是目前MALs類藥物檢測中最常用的色譜柱，其具有保留性強(qiáng)、分離效果好、適應(yīng)范圍廣等特點(diǎn)。在其他條件下，反相色譜柱隨柱溫升高分離性能有所下降，為保持系統(tǒng)穩(wěn)定性，選擇高室溫5 ℃即30 ℃作為柱溫箱溫度。研究比較了相關(guān)文獻(xiàn)[3,11-13]中流動(dòng)相配比，考察目標(biāo)色譜峰與雜質(zhì)峰分離度、保留時(shí)間、峰寬、峰對稱性，發(fā)現(xiàn)《中國獸藥典》中流動(dòng)相組成及比例最優(yōu)。

3.2 樣品前處理 組織樣品中藥物的提取溶劑一般遵循相似相溶原理。替米考星屬于MALs類，為極性、弱堿性化合物，易溶于乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑和磷酸鹽緩沖溶液[8]，國內(nèi)外報(bào)道關(guān)于組織中MALs的提取溶劑主要有乙腈[9,13]、乙腈-緩沖鹽溶液[3,4-6,12]，另有甲酸水-乙腈溶液[10]、甲醇[7]等。本試驗(yàn)比較甲醇、乙腈和磷酸鹽3種提取液提取效果后發(fā)現(xiàn)：甲醇提取液萃取后雜質(zhì)較多且難以濃縮；磷酸鹽緩沖液提取后難以濃縮、皮脂組織漂浮不易離心沉淀除雜，雜質(zhì)干擾較多；乙腈可沉淀蛋白，離心后與脂肪可分層，提取的樣品雜質(zhì)較少。最終選擇乙腈作為樣品提取劑。

提取液在較低溫度(50 ℃)濃縮，可防止藥物被破壞，濃縮至1～2 mL，可節(jié)省濃縮時(shí)間，又可避免完全吹干后藥物吸附、固化于離心管壁降低回收率。濃縮后的提取液用8 mL流動(dòng)相和1 mL正己烷渦旋溶解，減少藥物在離心管中殘留損失，有利于回收率提高。樣品提取過程中加入無水硫酸鈉可去除組織中的游離水，促使有機(jī)相和水相分離，通過對比試驗(yàn)得知添加無水硫酸鈉并不能明顯增加藥物的回收率。

常用于MALs類凈化的固相萃取柱有普通離子交換SPE柱、HLB柱、MCX柱等。普通離子交換SPE柱利用靜電吸引原理進(jìn)行萃取，對雜質(zhì)去除率較高但回收率較低。親水親脂平衡的HLB柱吸附劑的表面積增大2～3倍，增加了極性物質(zhì)保留的能力，但缺點(diǎn)亦是選擇性較差?；旌闲蛷?qiáng)陽離子交換MCX柱提供了離子交換和反相保留雙重模式，對堿性化合物具有高選擇性，可耐受有機(jī)溶劑，克服了傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)混合型吸附劑的局限性，保留效果、選擇性能大大提升。因替米考星為極性、弱堿性化合物，故選擇MCX柱作為凈化的固相萃取柱。選擇了6 cc(150 mg)和3 cc(60 mg)兩種規(guī)格MCX柱進(jìn)行比較，結(jié)果表明6 cc(150 mg)的MCX柱去雜質(zhì)效果好、回收率高。

MCX柱依次用10 mL甲醇、2 mL pH值5.0磷酸鹽緩沖液平衡，A液上樣后將B液作淋洗液可減少藥物在離心管中的損耗，同時(shí)使離子化藥物與吸附劑結(jié)合更加牢固且去除部分酸性雜質(zhì)；再用10 mL水和5 mL甲醇淋洗進(jìn)一步去除鹽類和部分中性雜質(zhì)。比較了3 mL、5 mL、8 mL甲醇淋洗效果及藥物回收率，發(fā)現(xiàn)8 mL甲醇淋洗雜質(zhì)去除率最好，但藥物回收率低于5 mL甲醇淋洗，綜合考慮選擇5 mL甲醇淋洗。比較了不同劑量的5%氨化甲醇、10%氨化甲醇、3%氨化乙腈、5%氨化乙腈、10%氨化乙腈對藥物的洗脫效果，最終選擇4 mL的 5%氨化甲醇作洗脫液，洗脫效果好且甲醇用量少，減少環(huán)境污染。

本試驗(yàn)建立了雞皮脂和腎臟組織中替米考星殘留量的HPLC測定方法，替米考星在雞皮脂組織中的檢測限和定量限分別為20 μg/kg和35 μg/kg，在雞腎臟組織中的檢測限和定量限分別為30 μg/kg和50 μg/kg，能夠滿足我國農(nóng)業(yè)部第235號公告中對替米考星在雞皮脂和腎臟組織中最高殘留限量殘留檢測需求，并通過了四川省獸藥監(jiān)察所和安徽省獸藥飼料監(jiān)察所的復(fù)核驗(yàn)證，該方法簡單、準(zhǔn)確、靈敏，適用于雞皮脂和腎臟組織中替米考星的殘留檢測。