徐豪杰，周建超，楊文輝

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450052)

丹參具有活血、調(diào)經(jīng)、止痛、祛瘀等功效。研究[1-2]顯示，丹參中含有數(shù)百種化學(xué)成分，主要分為水溶性的酚酸類和脂溶性的丹參酮類。丹參酮類是丹參的特征性成分之一，包括丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ等多種。其中丹參酮ⅡA和丹酚酸B被選為國(guó)家藥典中丹參質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，具有明顯的心血管保護(hù)作用。研究[3]發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮I等多種丹參酮類均具有抗腫瘤活性。目前關(guān)于隱丹參酮的研究較少，本實(shí)驗(yàn)主要研究隱丹參酮對(duì)宮頸鱗癌Siha細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用的影響，初步探討其抗腫瘤作用的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料宮頸鱗癌細(xì)胞株Siha，由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心提供；隱丹參酮，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，純度為98%。

試劑與儀器：高糖型DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司；四氮唑噻唑藍(lán)(MTT)，上海生物工程有限公司；牛血清，美國(guó)Gibco公司；鼠抗人E6、P53、P21、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單抗，美國(guó)Santa Cruz公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；LX-800型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，日本Epson公司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司；凝膠成像分析儀，瑞典Pharmacia公司；流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Siha細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2及相對(duì)飽和濕度。孵育2～3 d后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化傳代,選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Shia細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 MTT法測(cè)定隱丹參酮對(duì)Siha細(xì)胞的抑制作用 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Shia細(xì)胞，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，以細(xì)胞濃度3×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔培養(yǎng)基總體積為200 μL；空白對(duì)照組給予相同體積的磷酸鹽緩沖液；給藥組分別加入不同濃度的隱丹參酮(0.1、1、5、10、100 μmol·L-1)，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)4、8、12、16、20、24 h后，加入5 g·L-1的MTT(20 μL/孔)4 h后，吸去上清加入DMSO 150 μL/孔，微型震蕩器震蕩10 min，使其完全混勻溶解結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上于492 nm處測(cè)吸光度，每個(gè)濃度設(shè)平行重復(fù)6孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按以下公式計(jì)算抑制率，擬合后求IC50值。細(xì)胞增殖抑制率=(1-A試驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

1.2.3 細(xì)胞周期及凋亡的測(cè)定 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Siha細(xì)胞以1.0×105個(gè)/mL的細(xì)胞濃度接種于6孔板,分別設(shè)有空白對(duì)照組、給藥組(12、24、36、48 h)；隱丹參酮給藥濃度為(1、10、25 μmol·L-1)；空白對(duì)照組給予相同體積的磷酸鹽緩沖液。培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶消化，離心(1 000 r·min-1，5 min)，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，用體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇使細(xì)胞懸浮固定，置于4 ℃冰箱中保存30 min，-20 ℃過(guò)夜。經(jīng)核糖核酸酶消化，碘化丙啶染色，4 ℃避光染30 min后流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)分析，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。2 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%]。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞蛋白 隱丹參酮給藥后，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的Siha細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰上放置15 min, 12 000 r·min-1離心15 min，取上清，以Bradford法作蛋白定量后置-80 ℃貯存?zhèn)溆?。灌制質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。一抗(1500)，4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(15 000)，室溫孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。GAPDH檢測(cè)作為內(nèi)對(duì)照，進(jìn)行細(xì)胞間蛋白表達(dá)的比較。

2 結(jié)果

2.1 隱丹參酮對(duì)Siha細(xì)胞增殖的抑制作用不同濃度(0.1、1、5、10、100 μmol·L-1)的隱丹參酮給藥4、8、12、16、20、24 h后, 對(duì)Siha細(xì)胞的生長(zhǎng)呈明顯抑制作用。不同濃度(0、1、1、5、10、100 μmol·L-1)的隱丹參酮對(duì)Siha細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用有明顯劑量和時(shí)間依賴性。見圖1。

2.2 隱丹參酮對(duì)Siha細(xì)胞的細(xì)胞周期及早期凋亡的影響與空白對(duì)照組比較,各給藥組Siha細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生G0/G1期阻滯，S期所占比例隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)不斷減少，且隨著給藥時(shí)間的增加抑制作用更加明顯。見圖2。

圖1 不同濃度隱丹參酮作用不同時(shí)間后對(duì)Siha細(xì)胞的抑制作用

圖2 不同濃度隱丹參酮作用不同時(shí)間后Siha細(xì)胞生長(zhǎng)周期變化

2.3 隱丹參酮對(duì)Siha細(xì)胞的相關(guān)蛋白表達(dá)的影響隨著隱丹參酮(25 μmol·L-1)作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Siha細(xì)胞E6蛋白水平表達(dá)逐漸降低，P53和P21的蛋白水平表達(dá)逐漸升高。見圖3。

圖3 隱丹參酮(25 μmol·L-1)作用不同時(shí)間后Siha細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率及其導(dǎo)致的死亡率均高于發(fā)達(dá)國(guó)家[4]。與其他惡性腫瘤比較，宮頸癌多發(fā)病于中年女性[5]，一旦患病給患者及其家庭帶來(lái)極大痛苦和威脅。

隱丹參酮屬于丹參的脂溶性成分，具有菲醌結(jié)構(gòu)，其中菲環(huán)結(jié)構(gòu)可與DNA結(jié)合，而呋喃環(huán)和醌類結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生自由基，引起DNA損傷，從而抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成[6]。丹參酮通過(guò)抑制抗增殖細(xì)胞核抗原和細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。

細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，部分抗腫瘤藥物作用的強(qiáng)弱與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性呈正比。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為抗腫瘤藥物研發(fā)的新思路，以及評(píng)價(jià)療效的新指標(biāo)[8]。有研究[9]認(rèn)為大多化療藥物可以引起腫瘤細(xì)胞特定靶成分的損傷或功能喪失，從而引起細(xì)胞周期阻滯及進(jìn)入細(xì)胞凋亡。

目前，許多分化誘導(dǎo)劑能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其分化，這主要是由某些癌基因及抑癌基因的表達(dá)抑制、失活和活化所致，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制細(xì)胞原癌基因、誘導(dǎo)抑癌基因的表達(dá)，阻滯細(xì)胞進(jìn)入S期及其DNA合成，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的隱丹參酮對(duì)Siha細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用有明顯劑量和時(shí)間依賴性;流式細(xì)胞儀檢查表明，隱丹參酮對(duì)Siha細(xì)胞的細(xì)胞周期有明顯的阻滯，在抑制Siha細(xì)胞增殖的同時(shí)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，降低S期細(xì)胞比例，減慢腫瘤細(xì)胞的增殖速度，抑制DNA的合成并加速誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。DNA損傷后，P53或Mdm-2磷酸化，從而上調(diào)P21表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而促進(jìn)DNA修復(fù)或細(xì)胞凋亡[11]。感染了人乳頭瘤病毒(HPV)的宮頸癌細(xì)胞中P53的降解是通過(guò)E6蛋白介導(dǎo)的泛素化途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的，正常P53功能被E6蛋白所破壞[12]。P21基因是P53的效應(yīng)基因。本研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮能夠顯著抑制HPV E6蛋白水平的表達(dá)，同時(shí)Western blot法發(fā)現(xiàn)P53蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而誘導(dǎo)其下游的P21蛋白表達(dá)增加。

綜上所述，隱丹參酮能明顯抑制宮頸鱗癌Siha細(xì)胞的增殖，這與其抑制HPV E6蛋白的表達(dá)，使P53和P21的蛋白表達(dá)逐漸升高，P53功能恢復(fù)并啟動(dòng)凋亡，從而誘導(dǎo)Siha細(xì)胞凋亡有關(guān)。但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。