王麗嬌，李國平，戴 曦，史雅旭，伍 娟，楊小瓊△

(1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸內一科，四川瀘州 646000；2.四川省眉山市人民醫(yī)院呼吸內科 620010;3.四川省成都市第三人民醫(yī)院/西南交通大學附屬醫(yī)院呼吸內科 610000；4.澳門科技大學中藥質量研究國家重點實驗室/澳門藥物與健康應用研究院 999078；5.四川省第二中醫(yī)醫(yī)院呼吸內科，成都 610000)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。據(jù)統(tǒng)計，全世界約有2.35億哮喘患者，每年約有18萬人因哮喘死亡。其逐漸升高的發(fā)病率以及嚴重影響患者生活質量和肺功能的疾病狀態(tài)帶來了極大的社會、經(jīng)濟負擔。城市社區(qū)的哮喘負擔最為嚴重，特別是存在有典型環(huán)境暴露、缺乏醫(yī)療資源的低收入國家[1]。哮喘除了典型的氣流受限癥狀外，常合并肥胖、胃食管反流性疾病、焦慮癥和抑郁癥、過敏性疾病等。根據(jù)研究報道，焦慮癥和抑郁癥在哮喘患者中已較為普遍。

既往研究認為精神應激與類風濕性關節(jié)炎、心血管疾病、加速生物老化和過早死亡都有一定關系[2]。焦慮和抑郁與難治性哮喘、藥物依賴以及哮喘相關生活質量惡化關系密切[3]，在很大程度上增加了哮喘患者急性加重的風險和急診就醫(yī)的頻率。目前國內外針對哮喘合并焦慮/抑郁的相關研究認為可以從認知行為、心理教育和生物反饋等方向進行心理干預治療，但研究結果具有較大爭議。因此，本研究通過建立經(jīng)典小鼠哮喘模型探討慢性應激導致的焦慮/抑郁狀態(tài)對哮喘的影響，同時，選擇性5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑帕羅西汀(Paroxetine)在本實驗中被用于治療慢性應激所致的焦慮/抑郁狀態(tài)，以評估抗焦慮/抑郁治療對合并焦慮/抑郁狀態(tài)的哮喘小鼠的治療效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物 8～10周齡SPF級健康雌性C57BL小鼠購自重慶騰鑫生物有限公司，實驗前用糖水偏好測試篩選出30只符合實驗要求的小鼠(具體方法見糖水偏好測試)。將30只小鼠分為6組(n=5)并飼養(yǎng)于本校實驗動物中心SPF級動物房，每組飼養(yǎng)環(huán)境均一致，即光照節(jié)律12 h∶12 h(光照時間7：00～19:00)，室溫維持(23±3)℃、相對濕度50%～60%。所有小鼠均在安靜狀態(tài)下飼養(yǎng)，可自由進食及飲水。

1.2儀器與試劑 Buxco小動物全身體積描記檢測系統(tǒng)(Buxco，美國)；DM4000 Leica 光學顯微鏡(Leica，德國)；Allegra X-22R 低溫離心機(Beckman Coulter，美國)；電子天平(良平電子天平FA1004，上海)；海爾4 ℃冰箱等。雞卵清蛋白(Ovalbumin,北京Solarbio科技有限公司，A8040)；氫氧化鋁[Al2(OH)3,成都科龍化工試劑廠]；乙酰-β-甲基氯化膽堿(美國Sigma公司)；蔗糖(天津致遠化學試劑有限公司)；蘇木素-伊紅染液(HE，北京化學試劑公司)；1×PBS；4%多聚甲醛。

1.3方法

1.3.1實驗分組 將小鼠分為對照組(CTRL組)、哮喘組(OVA組)、應激組(CTRL/R組)、哮喘應激組(OVA/R組)、帕羅西汀組(CTRL/R+P組)、哮喘+帕羅西汀組(OVA/R+P組)。

1.3.2哮喘模型制備 OVA、OVA/R、OVA/R+P組小鼠在第0、7、14天分別腹腔內注射0.2 mL致敏液[100 μg/mL OVA與10 mg/mL Al2(OH)3的混懸液]，CTRL組和CTRL/R組予以等體積1×PBS腹腔注射。第21～27天，CTRL/R、OVA/R、CTRL/R+P組和OVA/R+P組小鼠同時每天給予持續(xù)束縛應激，并且在束縛應激后以1%的戊巴比妥按50 mg/kg下肢肌肉注射麻醉OVA、OVA/R組和OVA/R+P組小鼠，分別將50 μL激發(fā)液(2 mg/mL OVA-PBS溶液)以微泵注射器經(jīng)鼻緩慢滴入，其余組給予等量1×PBS處理(圖1)。

1.3.3慢性束縛應激模型 將小鼠置于實驗環(huán)境適應48 h，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜節(jié)律，小鼠可自由飲水、進食。在第21天稱量小鼠束縛前體質量。第21～27天，CTRL/R+P、OVA/R+P組小鼠在束縛前30 min按照10 mg/kg體質量予以帕羅西汀溶液(1 mg/mL)腹腔注射，然后將 CTRL/R、CTRL/R+P、OVA/R、OVA/R+P組小鼠置于50 mL錐形離心管中限制其身體自由移動，離心管管壁開密集通風口保持良好通氣，離心管置于鏤空的飼養(yǎng)架上，試驗中遠離食物及水，避免各種噪音，以控制實驗干預因素以外的應激因素，每天8:00～15:00束縛2 h。對照組同時禁食、禁水。束縛2 h后將各組小鼠放回籠中自由進食、飲水。

圖1 動物模型制備操作流程

1.3.4糖水偏好測試 糖水偏好測試分為適應期和測試期。適應期內，將小鼠分別放在獨立的籠子中，同時給小鼠1瓶純水和1瓶2%的蔗糖水，為避免位置偏好，每隔24 h交換兩瓶水的位置，連續(xù)適應3 d。適應期結束后所得的糖水偏好指數(shù)用于篩選小鼠，以確保每只小鼠對糖水的偏好基本正常，低于65%的小鼠不納入實驗。造模第26天小鼠自由進食飲水后移除所有籠子的水，禁水17 h后(需束縛的小鼠在第26天禁水15 h后開始束縛2 h，束縛后放回籠子)再同時給予小鼠1瓶2%蔗糖水，1 瓶純水，測試24 h，每隔12小時將兩瓶水的位置互換。結束后計算糖水偏好指數(shù)，并稱量束縛后體質量。糖水偏好指數(shù)=糖水消耗(g)/總液體消耗(糖水+純水)×100%。

1.3.5氣道反應檢測 用1×PBS將乙酰-β-甲基氯化膽堿配制成濃度梯度為6.25、12.5、25、50 mg/mL的溶液，分別對小鼠進行氣道霧化，霧化同時用Buxco小動物體積描記測試系統(tǒng)測試并記錄每只小鼠從霧化到反應結束期間的Penh值。每組小鼠測試開始時均適應5 min，每種濃度分別霧化1 min，反應2 min，恢復1 min。

Penh氣道縮窄指數(shù)=呼氣峰壓力(PEP)/吸氣峰壓力(PIP)×呼氣間歇(Pause),其中Pause=(呼氣相時間-呼氣相松弛時間)/呼氣相松弛時間。Te表示呼氣相時間；Tr表示呼氣相松弛時間。

1.3.6標本收集 (1) 腎上腺濕重與體質量測量：第28天處死實驗小鼠，測量小鼠體質量后手術分離雙側腎上腺并稱量濕重，計算得出腎上腺/體質量(mg/g)。(2) 肺泡灌洗及細胞分類計數(shù)：暴露氣管，結扎氣管近端，將1 mL在4 ℃冰箱中提前預冷的生理鹽水緩慢注入氣管并反復抽吸3次，收集總的肺泡灌洗液，1 500 r/min 4 ℃低溫離心10 min，將離心后的細胞沉淀用1 mL PBS重懸，取10 μL用于細胞計數(shù)。剩余的細胞懸液再次離心，留50 μL上清液重懸細胞，制作細胞涂片。HE染色后用顯微鏡計數(shù)200個白細胞并進行分類。(3)肺組織HE和PAS染色：將未行肺泡灌洗的小鼠左肺用4%多聚甲醛固定后送病理科行HE及PAS染色，鏡下觀察并行肺組織炎癥評分和中型氣道PAS陽性細胞豐度評分。

2 結 果

2.1慢性應激導致小鼠體質量降低，糖水的攝取減少和腎上腺/體質量比值顯著升高 應用了慢性束縛應激成功構建了焦慮/抑郁小鼠模型，小鼠在應激后出現(xiàn)對糖水的興趣缺失，體質量不增反降等表現(xiàn)，且抑郁狀態(tài)小鼠糖水偏好指數(shù)明顯下降。在給予帕羅西汀治療后，小鼠的體質量下降以及糖水偏好變化有所改善，腎上腺/體質量比值下降。同時，結果顯示OVA/R組小鼠實驗前后體質量變化和糖水偏好指數(shù)變化較OVA組小鼠和CTRL/R組小鼠更為明顯，并且腎上腺/體質量比值最高，驗證了動物模型的成功構建(圖2、圖3A)。

2.2焦慮/抑郁狀態(tài)導致哮喘模型小鼠氣道高反應加重 本實驗采用小動物體積描記儀完成小鼠支氣管激發(fā)試驗，動態(tài)觀察并記錄小鼠吸入支氣管激發(fā)劑乙酰膽堿后的氣道反應性。OVA/R組小鼠較OVA組小鼠在吸入乙酰膽堿后氣道高反應更為嚴重，但給予了帕羅西汀的OVA/R+P組小鼠氣道高反應較OVA/R組小鼠有所緩解(圖3B)。

A:小鼠束縛前后體質量,*:P<0.05,#:P>0.05;B:小鼠束縛前后糖水偏好指數(shù),*:P<0.05,#:P>0.05

圖2 應激對小鼠體質量和糖水偏好指數(shù)的影響

2.3焦慮/抑郁狀態(tài)導致哮喘模型小鼠氣道炎癥加重和炎癥細胞浸潤增加 本研究通過對小鼠肺組織病理切片作HE染色后可見OVA組小鼠肺組織氣道、氣道旁、血管旁及肺泡內有大量炎癥細胞滲出，部分區(qū)域肺泡間隔明顯增寬，而OVA/R組小鼠上述表現(xiàn)更為明顯。按炎癥評分標準(表1)評分可知，OVA/R組小鼠肺組織炎癥較OVA組嚴重(圖4)。

通過肺泡灌洗液中炎癥細胞計數(shù)和炎癥細胞分類分析發(fā)現(xiàn)，OVA/R組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞顯著增多，以嗜酸性粒細胞和中性粒細胞增加較為明顯(圖5)。值得注意的是，使用了抗抑郁藥的OVA/R+P組小鼠與OVA/R組小鼠比較，其氣道炎癥評分以及肺泡灌洗液中炎癥細胞計數(shù)均降低。

A:小鼠腎上腺/體質量比,*:P<0.05,#:P>0.05;B:小鼠氣道反應Penh值

圖3 小鼠腎上腺/體質量質量比與氣道反應Penh值

A:肺組織切片HE染色;B:氣道及氣道旁炎癥評分，*:P<0.05;C:肺泡炎癥評分,*：P<0.05

圖4 肺組織HE染色及炎癥評分

A:肺泡灌洗液細胞涂片HE染色;B:BALF炎癥細胞計數(shù);C:BALF炎癥細胞分類計數(shù)，*：P<0.05;D:BALF中性粒細胞計數(shù)，*：P<0.05

圖5 BALF細胞分類計數(shù)

A:氣道杯狀細胞PAS染色;B:PAS陽性杯狀細胞豐度評分標準;C:PAS評分，*：P<0.05

圖6 氣道PAS染色及杯狀細胞豐度評分

2.4焦慮/抑郁狀態(tài)促進哮喘小鼠氣道上皮杯狀細胞增生和黏液高分泌 本研究在對小鼠肺組織進行PAS染色觀察氣道上皮杯狀細胞增生情況的發(fā)現(xiàn)，OVA/R組小鼠PAS評分較OVA組小鼠明顯增加，帕羅西汀治療后的OVA/R+P組小鼠PAS評分則較OVA/R組小鼠有所降低(圖6)。

3 討 論

哮喘是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質性疾病。它常伴有隨著時間和強度變化的呼吸道癥狀，如喘息、呼吸急促、胸悶和咳嗽及可變的呼氣氣流受限。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全世界大約有2.35億哮喘患者，約占總人口的4.3%，其中亞洲患者約占總人口的2.9%，據(jù)估計，在未來十年里全球哮喘患病人數(shù)將增加一億人，超過80%的哮喘死亡病例發(fā)生在低收入和中下收入國家，僅2015年全球就有33.8萬人死于哮喘[4]。心理精神障礙中的焦慮癥和抑郁癥是哮喘患者的常見并發(fā)癥，既往曾用“心因哮喘”來描述因心理和情緒因素而加重疾病嚴重程度的哮喘病例。哮喘患者比普通人更易患焦慮癥和抑郁癥，與此同時，如果早期(如青少年期)受到心理精神問題的困擾，則成年后哮喘發(fā)作的風險將顯著增加[5]。

炎癥通常被認為是機體對物理損傷和感染的主要反應，心理應激可以提高免疫系統(tǒng)中參與炎性反應的成分，從而使炎癥成為與多種疾病狀態(tài)相聯(lián)系的一種潛在共同途徑。有研究報道，應激不僅可引起血漿炎癥標志物的增加，還可增強哮喘患者對致敏源的反應，有20%～35%的哮喘患者在應激期間出現(xiàn)病情加重。雖然有研究報道稱急性應激通過激活HPA軸升高內源性皮質激素水平，從而降低氣道FeNO水平。但慢性或者長期持續(xù)的應激可導致HPA軸對應激的適應，出現(xiàn)糖皮質激素受體表達下調，下丘腦和垂體分泌促皮質激素釋放因子和促腎上腺皮質激素的負反饋消失，皮質類固醇反應的減弱。此外，連續(xù)7 d的應激(長期應激)表現(xiàn)出與糖皮質激素反應無關的炎細胞數(shù)量增加。而促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)敲除的小鼠也表現(xiàn)出氣道炎性反應的增強和杯狀細胞的增生[6-7]。說明慢性應激可使炎性反應對糖皮質激素抵抗，導致促皮質激素釋放因子負反饋的消失，由此可促進炎性反應。這或許能解釋為何伴有焦慮/抑郁的哮喘患者對激素治療不敏感。

慢性應激能引起HPA軸的激活，導致相應腺體增生，通過減弱皮質類固醇反應加重氣道炎性反應。實驗中發(fā)現(xiàn)應激導致小鼠腎上腺增生，腎上腺與體質量之比也較非應激小鼠增高，同時加重了哮喘小鼠氣道對乙酰膽堿的反應，表現(xiàn)出明顯的氣道高反應性。而且，無論是BALF炎細胞的分類計數(shù)，肺組織HE染色炎癥評分還是氣道PAS陽性杯狀細胞豐度評分均表明應激可加重肺組織炎癥細胞的浸潤，促進氣道杯狀細胞增生和黏液高分泌。與既往研究報道的早期應激可加重成年小鼠氣道炎性反應和氣道高反應一致[8]。

據(jù)報道，應激產(chǎn)生的激素可通過多種途徑調節(jié)免疫反應，如糖皮質激素和兒茶酚胺通過抑制抗原提呈細胞和Th1細胞的產(chǎn)生，同時上調Th2細胞因子的分泌介導Th2轉化，而哮喘正是一個以Th2細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)產(chǎn)生為主的炎性反應，能促進嗜酸性粒細胞在氣道炎癥部位和外周血中的聚集[9]。實驗發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠BALF分類計數(shù)中除嗜酸性粒細胞升高以外還伴隨中性粒細胞的增多，且哮喘應激小鼠這兩種細胞增多更顯著，其機制尚不清楚。已知IL-17是由Th17細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等細胞分泌的細胞因子，是重癥哮喘的獨立危險因素。近年來發(fā)現(xiàn)高水平的IL-17(尤其是IL-17A和IL-17F)與中性粒細胞在肺組織的過度聚集、氣道高反應、氣道重塑有關。IL-17A還能增加乙酰膽堿引起的氣道平滑肌收縮，并誘導氣道平滑肌的遷移[10-11]。在致敏階段，肺源性Th17細胞不僅增強了中性粒細胞氣道炎癥，還增強了Th2細胞介導的嗜酸性氣道炎癥。并且MCKINLEY等[13]發(fā)現(xiàn)，Th17細胞介導的氣道炎癥和氣道高反應在小鼠體內表現(xiàn)出激素抵抗性，提示Th17細胞在激素抵抗哮喘中的潛在作用[12-13]。筆者猜想，應激或許能促進Th17細胞分泌IL-17，從而誘導哮喘應激小鼠中性粒細胞升高，這有待進一步的研究證實。

5-HT是一種主要在胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)合成的單胺類神經(jīng)遞質，除了對胃腸道和神經(jīng)系統(tǒng)的影響外，非神經(jīng)元性5-HT還調節(jié)包括炎癥在內的其他生理過程。帕羅西汀是近年來應用較多的5-HT再攝取拮抗劑，它通過阻礙突觸前神經(jīng)元表面的5-HT轉運體的表達來抑制5-HT再攝取，在治療焦慮癥和抑郁癥方面療效顯著。研究發(fā)現(xiàn)，中樞和外周組織中促炎因子(IL-6和TNF-α)水平的升高促進了抑郁癥的發(fā)展，而帕羅西汀能促進巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α同時抑制IL-6的生成，并且在神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞中均具有抗炎作用。此外，帕羅西汀能減輕T淋巴細胞的活化，減少該細胞向膠原誘導性關節(jié)炎關節(jié)的浸潤[14]。正常情況下，肺泡灌洗液以單核巨噬細胞和淋巴細胞為主。在實驗中，經(jīng)帕羅西汀治療后小鼠的氣道反應與哮喘應激小鼠相比明顯減輕，且嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數(shù)量較哮喘應激小鼠下降，單核細胞和淋巴細胞數(shù)量有所升高，但仍較對照組減少。有研究發(fā)現(xiàn)，束縛應激小鼠氣道炎癥的增加與Th2細胞因子水平升高有關，并證明了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的μ-阿片受體(μ-opioid receptor,MOR)參與應激性哮喘的發(fā)作。MOR也在炎細胞中表達，包括T細胞、B細胞、單核巨噬細胞、多核白細胞和樹突狀細胞，淋巴細胞表面的MOR的激活能誘導Th2細胞分化及Th1細胞向Th2細胞的轉化。慢性心理應激可通過激活MOR刺激HPA軸和交感-腎上腺髓質系統(tǒng)(SAM)分別釋放皮質醇和兒茶酚胺，從而加重過敏性氣道炎癥[15-16]。由此猜測帕羅西汀或許能通過抑制淋巴細胞和單核細胞表面MOR的表達從而減輕哮喘應激小鼠氣道炎癥，具體機制有待進一步研究。