張擁軍，彭伯堅(jiān)，曹天生，盧秀珊，郭曙光

(1.廣東省廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 510800；2.廣東省廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院普外科 510800；3.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院體檢科，廣州 510630)

胃癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一[1-2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),每年新發(fā)病例約有100萬(wàn)例[3-4]。盡管目前胃癌治療取得了一定的進(jìn)展，但晚期胃癌患者的總體療效不太理想，5年生存率僅為5%～20%[5-6]。近年來(lái)，眾多的研究表明傳統(tǒng)中草藥具有顯著的抗腫瘤活性[7-9]。丹參酮ⅡA(TanⅡA)是天然植物丹參的主要活性成分，前期的研究已發(fā)現(xiàn)它具有多種藥理活性，比如緩解心絞痛，有效改善血流動(dòng)力學(xué)等[10-12]。近年來(lái)，丹參酮ⅡA在乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌中的抗腫瘤活性也廣受研究者青睞[13-14]。雖然有研究表明TanⅡA能抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，但其潛在的分子機(jī)制尚不清楚[15-16]。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子STAT家族的成員之一[17]。它廣泛參與調(diào)節(jié)了一系列生物過程,如細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生、血管生成和表皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等[18]。磷酸化STAT3分子上的2個(gè)磷酸化位點(diǎn)酪氨酸705(Tyr705)和絲氨酸727(Ser727)對(duì)于STAT3組成性激活以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮著關(guān)鍵作用[19-21]。有研究表明STAT3 的構(gòu)成性激活可以促進(jìn)胃癌的進(jìn)一步惡化和發(fā)展[22-23]。因此，以STAT3為靶點(diǎn)，發(fā)掘新的能抑制STAT3組成性激活的化合物對(duì)于治療人類胃癌具有重要的臨床意義。本研究中采用人胃癌細(xì)胞株，并給予TanⅡA處理，探討TanⅡA對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，并明確其作用機(jī)制是否與抑制STAT3活化有關(guān)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及試劑 人胃癌細(xì)胞株(SNU-638、MKN1和AGS)購(gòu)自國(guó)家細(xì)胞資源中心(中國(guó)科學(xué)院，上海)。SNU-638和MKN1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，AGS細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并置于含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱。TanⅡA購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。cleaved caspase-3、Bcl和Bax抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司，p-STAT3和STAT3抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。FLAG-STAT3和phRL-TK質(zhì)粒購(gòu)自生工公司。

1.2四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于 96 孔培養(yǎng)板中過夜。隨后給予不同濃度的TanⅡA處理不同時(shí)間后，每孔加入20 μL MTT染料繼續(xù)孵育2 h。小心移除培養(yǎng)基并加入溶解/終止溶液。使用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測(cè)各孔吸光度并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3細(xì)胞凋亡檢測(cè) 當(dāng)不同濃度的TanⅡA處理細(xì)胞后，收集細(xì)胞至離心管中，離心棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌。隨后使用Annexin V和PI雙染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。根據(jù)比例計(jì)算不同藥物濃度對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

1.4Western blot 當(dāng)用不同濃度的TanⅡA處理細(xì)胞后，加入裂解緩沖液裂解細(xì)胞并收集、提取總蛋白進(jìn)行定量。隨后采用SDS-PAGE分離，PVDF膜電轉(zhuǎn)，脫脂牛奶(5 %)封閉1 h,分別加入一抗孵育4 ℃過夜。次日加入TBST緩沖液洗膜3次后加入辣根過氧化酶標(biāo)記二抗，室溫?fù)u床孵育1 h后用TBST緩沖液洗膜3次。最后采用ECL法顯影,并進(jìn)行定量分析。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染和STAT3轉(zhuǎn)錄活性 根據(jù)Lipofectamine 2000使用說(shuō)明書，將 FLAG-STAT3質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒phRL-TK分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，并給予指定濃度的TanⅡA處理。隨后用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定STAT3的轉(zhuǎn)錄活性。

2 結(jié) 果

2.1TanⅡA抑制人胃癌細(xì)胞增殖 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TanⅡA能以時(shí)間和劑量依賴的方式有效抑制SNU-638細(xì)胞增殖(圖1A和1B)。10 μg/ mL Tan ⅡA表現(xiàn)出最強(qiáng)抗腫瘤活性，因此被用于后續(xù)研究。與此同時(shí)，當(dāng)給予不同濃度TanⅡA處理人胃癌MKN1和AGS細(xì)胞之后， TanⅡA也能明顯抑制細(xì)胞增殖(圖1C和1D)，但以SNU-638細(xì)胞活性最佳，因此SNU-638細(xì)胞被選擇用于進(jìn)一步研究。

2.2TanⅡA誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡 當(dāng)Annexin-V/PI 雙染色標(biāo)記TanⅡA處理SNU-638細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)TanⅡA對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響。圖2A，2B顯示，TanⅡA處理之后能明顯增加凋亡細(xì)胞比例，百分比由7.77%±2.24%(對(duì)照組)增加到TanⅡA處理組13.80%±4.06%(2.5 μg/mL)，22.70%±4.25%(5 μg/mL)和32.87%±6.80%(10 μg/mL)。圖2C顯示TanⅡA處理之后能誘導(dǎo)Bax和cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)，并抑制Bcl蛋白水平。

A:TanⅡA對(duì)3種胃癌細(xì)胞增殖的時(shí)效、量效關(guān)系；B:TanⅡA對(duì)SUN-638細(xì)胞增殖的影響；C：TanⅡA對(duì)MKN1細(xì)胞增殖的影響；D:TanⅡA對(duì)AGS細(xì)胞增殖的影響

圖1 TanⅡA對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖的影響

A:Annexin V、PI雙染色細(xì)胞凋亡圖；B:相對(duì)細(xì)胞凋亡率；C：Western blot蛋白條帶及相對(duì)蛋白表達(dá)

圖2 TanⅡA對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

A:TanⅡA對(duì)STAT3磷酸化的影響；B:TanⅡA對(duì)STAT3轉(zhuǎn)錄活性的影響；C:過表達(dá)STAT3對(duì)細(xì)胞增殖的影響；D:過表達(dá)STAT3對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

圖3 TanⅡA對(duì)STAT3信號(hào)通路的影響

2.3STAT3在TanⅡA抑制人胃癌細(xì)胞增殖中的作用 如圖3A所示， TanⅡA(5,10 μg/mL)處理SNU-638細(xì)胞能有效抑制STAT3中Tyr705位點(diǎn)的磷酸化水平(約54%和77%)。為了進(jìn)一步證實(shí)STAT3信號(hào)通路是否參與了TanⅡA抗胃癌細(xì)胞增殖過程，本研究采用了SNU-638細(xì)胞與p-STAT-LUC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。雙熒光素報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示TanⅡA(5,10 μg/ mL)處理后能有效降低STAT3的活性(圖3B)。STAT3過表達(dá)后能顯著減少TanⅡA抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的比例(圖3C和D)。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)了中藥丹參分離得到的生物活性組分TanⅡA能有效抑制人胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具體機(jī)制是由于 TanⅡA 作用于STAT3的磷酸化Tyr705位點(diǎn)從而抑制STAT3磷酸化水平，STAT3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了推斷。本研究結(jié)果表明TanⅡA能有效抑制STAT3活化過程，從而發(fā)揮抗胃癌作用。

胃癌是常見惡性腫瘤,其病死率居全球第三[24]。近年來(lái)盡管在胃癌的診斷和治療方面取得了較大進(jìn)展，但胃癌患者的總體預(yù)后仍然較差[25-26]。目前的治療方式能夠在一定程度上控制病情,延長(zhǎng)患者生存期,但嚴(yán)重的毒副作用不僅會(huì)影響復(fù)發(fā)患者的生活質(zhì)量,甚至還會(huì)危及患者的生命[27]。因此，研發(fā)用于胃癌治療的新藥物具有重要的臨床意義。

TanⅡA是從丹參根莖提取的活性成分，大量證據(jù)表明TanⅡA對(duì)多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用[28]。本研究發(fā)現(xiàn)TanⅡA處理之后可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加Bax和cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)并下調(diào)Bcl蛋白水平。前期研究報(bào)道STAT3信號(hào)通路的組成性活化被認(rèn)為是癌癥發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)展的重要因素[20,29]。本研究發(fā)現(xiàn)TanⅡA處理后可明顯抑制體內(nèi)STAT3磷酸化過程，而且表現(xiàn)出劑量依賴性。當(dāng)細(xì)胞中過表達(dá)STAT3時(shí)，TanⅡA對(duì)細(xì)胞增殖的抑制比例以及誘導(dǎo)SNU-638細(xì)胞凋亡顯著減少。本研究闡明了STAT3在TanⅡA調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和凋亡過程中的作用。但是，TanⅡA在體內(nèi)是否發(fā)揮抗胃癌活性，TanⅡA如何影響體內(nèi)胃癌腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，以及STAT3如何參與調(diào)控值得進(jìn)一步探討。不僅如此，TanⅡA通過其他機(jī)制起作用的可能性不能排除，值得深入研究。而本研究仍存在一些局限，比如應(yīng)該同時(shí)納入正常的胃細(xì)胞進(jìn)行比較分析，從而進(jìn)一步闡述TanⅡA的作用是癌癥特異性的。綜上所述，本研究認(rèn)為TanⅡA可能通過下調(diào)STAT3活化水平從而發(fā)揮抗胃癌活性。