楊莉莉，曹廣海△，李東曉，張耀東，劉翠華

(1.鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院腎臟風(fēng)濕科,鄭州 450018；2.河南省兒童遺傳代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450018)

家族性地中海熱(FMF)是一種自身炎癥性疾病，其臨床特點(diǎn)是不定期反復(fù)發(fā)熱，一般持續(xù)0.5～3.0 d后自行緩解，并伴有漿膜炎、淀粉樣變、關(guān)節(jié)炎、腹膜炎及非淀粉樣腎小球病[1-2]。少數(shù)病例只有發(fā)熱這1個(gè)癥狀[3]。該病致病基因?yàn)镸EFV(MIM 608107)，遺傳方式有常染色體顯性遺傳(MIM 134610)和常染色體隱性遺傳(MIM 249100)，其中以常染色體隱性遺傳較為常見(jiàn)[4]。FMF在地中海沿岸人群中發(fā)病率高，以往亞洲及其他地區(qū)人群中報(bào)道較為少見(jiàn)，但自2002年日本首例FMF報(bào)道以來(lái)，亞洲地區(qū)對(duì)該病的認(rèn)識(shí)也逐漸加深，我國(guó)近年也零星報(bào)道了一些兒童及成人的FMF病例[3,5-6]。

MEFV基因位于16號(hào)染色體短臂上，有10個(gè)外顯子，最常見(jiàn)的MEFV基因變異有5種：10號(hào)外顯子上的p.M680I、p.M694V、p.M694I和p.V726A及2號(hào)外顯子上的p.E148Q，這些變異占到了FMF中的65%～95%[7-8]。本文報(bào)道1例FMF患者，其攜帶有常見(jiàn)的p.E148Q變異，另外攜帶1個(gè)內(nèi)含子變異，雖然該變異已經(jīng)被收錄于自身炎癥性疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)-Infevers中，但是該位點(diǎn)在非阿拉伯人群中未見(jiàn)報(bào)道，同時(shí)在國(guó)內(nèi)也是首次報(bào)道[9]。本研究豐富了國(guó)內(nèi)該病的基因突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，為該病的遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷及治療提供了更多的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 患兒，男，13歲，以間斷發(fā)熱4+年為主訴入院。4年前患兒無(wú)明顯誘因出現(xiàn)發(fā)熱，熱峰40 ℃，熱前有畏寒、無(wú)寒戰(zhàn)、咳嗽、驚厥、吐瀉、皮疹、腹痛和腹瀉等，口服退燒藥可降至正常。之后每2周至1個(gè)月發(fā)熱1次。期間分別在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院和診所治療，給予阿奇霉素、頭孢他啶、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉等抗感染治療，患兒體溫?zé)o明顯好轉(zhuǎn)，發(fā)熱持續(xù)1～7 d，發(fā)熱期間無(wú)其他伴隨癥狀，精神狀態(tài)好，飲食睡眠正常，大小便正常。既往體質(zhì)可，3年前行扁桃體切除術(shù)，無(wú)傳染病史，無(wú)食物、藥物過(guò)敏史和輸血史，預(yù)防接種史隨當(dāng)?shù)?，個(gè)人史無(wú)特殊。家族史：父母及姐姐體健?；純籂敔斒畮讱q時(shí)曾有3年時(shí)間經(jīng)常發(fā)熱，每次發(fā)熱幾天，均未給予特殊治療，體溫能自行降至正常，14歲后體溫完全正常，未再有類似癥狀，其余家族成員無(wú)相關(guān)病史。查體：身高162 cm,體質(zhì)量49 kg，生長(zhǎng)發(fā)育正常。神志清，精神一般，全身皮膚黏膜無(wú)皮疹、黃染及出血點(diǎn)。淺表淋巴結(jié)無(wú)腫大。心、肺、腹查體無(wú)明顯異常，神經(jīng)系統(tǒng)檢查陰性。血常規(guī)：白細(xì)胞5.48×109/L，中性粒細(xì)胞比例 62.8%，淋巴細(xì)胞比例30.8%，血紅蛋白122 g/L，血小板 311×109/L；C反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)正常，外周血涂片未見(jiàn)異常形態(tài)血細(xì)胞。血液生化檢查未見(jiàn)異常，尿常規(guī)、大便常規(guī)、凝血功能未見(jiàn)異常，淋巴細(xì)胞亞群未見(jiàn)明顯異常。免疫球蛋白(Ig)：IgG 5.51 g/L，IgM 0.92 g/L，IgA 0.58 g/L。補(bǔ)體C3、C4正常；類風(fēng)濕因子(1.0 IU/mL)正常；銅藍(lán)蛋白 84.66 mg/dL，EB病毒(EBV)及巨細(xì)胞病毒(CMV)-DNA定量均為陰性；半乳甘露聚糖小于0.1 μg/L，真菌D-葡聚糖小于10 pg/mL；抗鏈球菌溶血素“O”抗體正常，結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)未見(jiàn)異常，血培養(yǎng)、腦脊液常規(guī)、生化、培養(yǎng)均未見(jiàn)異常，呼吸道病原均為陰性，紅細(xì)胞沉降率 64 mm/h，自身抗體譜、中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)譜、抗心磷脂抗體、類風(fēng)濕因子均為陰性，甲胎蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、癌胚抗原等腫瘤標(biāo)記物均正常，骨髓細(xì)胞學(xué)檢查未見(jiàn)異常，心臟彩超、腹部彩超未見(jiàn)異常，頭顱、胸部、雙腎上腺CT平掃均未見(jiàn)異常。

1.2方法

1.2.1基因篩查 本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，征得患兒監(jiān)護(hù)人知情同意后，入院3 d時(shí)抽取患兒外周血約2 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，混勻后，將樣品送至北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所檢測(cè)，使用靶向捕獲技術(shù)(GenCap Enrichment Kit,Mygenostics)和高通量測(cè)序(Illumina HiSeq 2500)技術(shù)進(jìn)行免疫相關(guān)基因篩查。測(cè)序數(shù)據(jù)利用BWT算法與UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)提供的人類基因組參考序列(hg19)進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)對(duì)目標(biāo)區(qū)域的覆蓋度和測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。通過(guò)ClinVar、在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM)和人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(HGMD)等查找變異位點(diǎn)或疑似致病突變的收錄情況，進(jìn)行基因突變致病的注釋。

1.2.2家系分析 對(duì)患兒進(jìn)行二代測(cè)序送檢的同時(shí)，抽取患兒父母外周血約2 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，混勻后，將樣品送至北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所檢測(cè)。根據(jù)高通量測(cè)序的分析結(jié)果，使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)MEFV基因2號(hào)外顯子和5號(hào)內(nèi)含子的擴(kuò)增引物。經(jīng)過(guò)PCR，產(chǎn)物切膠純化后待用。純化的PCR 產(chǎn)物在全自動(dòng)測(cè)序儀ABI3500上進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Chromas 2.41軟件分析，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中序列比對(duì)檢索工具(BLAST)與正常序列(NG_007871.1)進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié) 果

2.1診療過(guò)程 該患兒僅有反復(fù)發(fā)熱1項(xiàng)臨床表現(xiàn)，臨床表現(xiàn)不典型，院外多次行抗感染、抗炎治療效果欠佳，入院后除外感染性、風(fēng)濕性疾病、免疫缺陷病、血液系統(tǒng)疾病和腫瘤等因素后，結(jié)合患兒祖父曾有反復(fù)發(fā)熱病史，考慮遺傳相關(guān)的自身免疫性疾病可能，進(jìn)行靶向捕獲測(cè)序，篩查致病基因。

2.2基因檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行免疫相關(guān)基因篩查，檢測(cè)平均測(cè)序深度182X，目標(biāo)捕獲區(qū)域30X覆蓋率為93.1%，Q30為96%，視為測(cè)序質(zhì)量合格。高通量測(cè)序結(jié)果顯示，患兒基因組中的MEFV 基因具有c.442G>C(p.E148Q)和c.1588-69G>A復(fù)合雜合變異，經(jīng)Sanger測(cè)序家系驗(yàn)證(圖1)，前一變異遺傳自母親，后一變異遺傳自父親?；驒z測(cè)結(jié)果顯示，患兒父親的MEFV檢測(cè)結(jié)果為：c.442G>C(雜合)、c.1588-69G>A(純合)；其母親的MEFV檢測(cè)結(jié)果為：c.442G>C(純合)、c.1588-69G>A(雜合)。HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)變異位點(diǎn)和疾病的關(guān)聯(lián)程度等信息對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行分類：(1)致病突變(DM)；(2)疑似致病突變(DM？)；(3)疾病相關(guān)的多態(tài)性變異(DP)；(4)有功能證據(jù)支持的疾病相關(guān)多態(tài)性變異(DFP)；(5)體外/實(shí)驗(yàn)室或體內(nèi)功能的多態(tài)性變異(FP)；(6)移碼或截?cái)嘧儺?FTV)。c.442G>C在HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中的分類為DP，c.1588-69G>A的分類為DM。

2.3治療及隨訪 基因確診，家長(zhǎng)簽署知情同意書(shū)后，初始給予該患兒秋水仙堿每次0.5 mg，1天1次口服(合0.01 mg·kg-1·d-1)。服藥4周后患兒至本院門診復(fù)診，期間發(fā)熱1次，體溫39.0 ℃，僅1次，口服布洛芬混懸液后降至正常。發(fā)熱時(shí)無(wú)咽痛、咳嗽、皮疹等表現(xiàn)，服藥期間未出現(xiàn)皮疹、惡心、嘔吐等不適。復(fù)查肝腎功能、血常規(guī)、CRP均正常，紅細(xì)胞沉降率50 mm/h。遂調(diào)整秋水仙堿每次0.5 mg，1天2次口服(合0.02 mg·kg-1·d-1)，患兒每1～2個(gè)月門診隨訪1次，均未再發(fā)熱，服藥第6個(gè)半月時(shí)復(fù)查紅細(xì)胞沉降率將至正常。

A:c.442G>C測(cè)序圖；B：c.1588-69G>A測(cè)序圖。箭頭標(biāo)出的位置為突變位點(diǎn)

圖1 Sanger測(cè)序結(jié)果

3 討 論

FMF多見(jiàn)于地中海地域的人群，如阿拉伯人、土耳其人和亞美尼亞人等，在土耳其的患病率約為1∶1 000[10]。該病在非地中海地域的人群中報(bào)道較少，且臨床表現(xiàn)常不典型。雖然中國(guó)的病例并不多見(jiàn)，但是在日本，F(xiàn)MF已經(jīng)不再被認(rèn)為是罕見(jiàn)病[11]。因此提高國(guó)內(nèi)醫(yī)生對(duì)該病的認(rèn)識(shí)，對(duì)防止誤診誤治至關(guān)重要。

1997年Tel Hashomer標(biāo)準(zhǔn)被提出以后，就成為最普遍的FMF診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，其包括4項(xiàng)主要標(biāo)準(zhǔn)，5項(xiàng)次要標(biāo)準(zhǔn)和10項(xiàng)支持準(zhǔn)則。滿足以下4種情況即可診斷：(1)符合1項(xiàng)主要標(biāo)準(zhǔn)；(2)符合2項(xiàng)次要標(biāo)準(zhǔn)；(3)1項(xiàng)次要標(biāo)準(zhǔn)加5項(xiàng)支持準(zhǔn)則；(4)1項(xiàng)次要標(biāo)準(zhǔn)加前5項(xiàng)支持準(zhǔn)則中的4條[12]。Tel Hashomer標(biāo)準(zhǔn)是以猶太成年人的患病指標(biāo)建立的，因此對(duì)于兒童診斷特異性較差[13-14]。YALCINSKAYA等[15]在2009年提出并驗(yàn)證了適用于兒童的診斷標(biāo)準(zhǔn)，共有5項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，滿足其中的2條即可診斷。這5項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)是：(1)發(fā)熱，腋下溫度大于38 ℃，持續(xù)6～72 h，發(fā)作3次及以上；(2)腹痛，持續(xù)6～72 h，發(fā)作3次及以上；(3)咽痛，持續(xù)6～72 h，發(fā)作3次及以上；(4)關(guān)節(jié)炎癥，持續(xù)6～72 h，發(fā)作3次以上；(5)FMF家族史。本患兒符合第1、5條，因此診斷為FMF。

除了根據(jù)臨床診斷，基因?qū)W檢測(cè)也是FMF診斷的重要依據(jù)，MEFV作為FMF的致病基因已被廣泛研究。中國(guó)FMF的患病率未見(jiàn)報(bào)道，但是已經(jīng)報(bào)道過(guò)25例臨床病例，其中17例兒童，8例成人(其中2例外國(guó)人)，沒(méi)有明顯的性別差異[3,5,16-21]。目前，在自身炎癥性疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)收錄了333個(gè)MEFV基因的相關(guān)變異。本病例中的c.442G>C(p.E148Q)變異，是5種最常見(jiàn)的變異之一，但是由于其人群頻率過(guò)高，且外顯率偏低的問(wèn)題，和FMF之間的關(guān)系頗有爭(zhēng)論。在日本的一項(xiàng)調(diào)查中，p.E148Q雖然在正常人中的比例為24.8%，但是在FMF患者中的比例高達(dá)39.1%，因此p.E148Q仍然被認(rèn)為是和FMF相關(guān)的變異[11]。目前國(guó)內(nèi)報(bào)道過(guò)的25例患者中，有基因檢測(cè)結(jié)果的21例，其中15例患者含有p.E148Q的變異，即患者基因組中攜帶p.E148Q的變異的概率是72%。韓麗芳等[22]在2006年，對(duì)57例中國(guó)人的DNA樣本進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)p.E148Q的變異率最高，達(dá)到45%，這個(gè)數(shù)據(jù)雖然可能包括了FMF患者，但是仍明顯低于75%這個(gè)比例，因此p.E148Q在中國(guó)人群中，應(yīng)該被認(rèn)為是和FMF相關(guān)的變異，這和c.442G>C在HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中的分類(DP)是一致的。

FMF患者有不少是復(fù)合雜合變異，有的患者甚至含有4種變異[11]。本例患兒也為MEFV基因復(fù)合雜合變異，除p.E148Q外，還有一內(nèi)含子c.1588-69G>A變異，內(nèi)含子變異不會(huì)直接影響氨基酸序列，而是通過(guò)影響RNA剪接等過(guò)程，最終影響了編碼蛋白的序列或結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致了疾病的發(fā)生。該變異已經(jīng)被收錄于Infevers數(shù)據(jù)庫(kù)中，但是該位點(diǎn)在非阿拉伯人群中屬首次報(bào)道[9]。c.1588-69G>A在HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中的分類為DM，本例患兒的臨床表現(xiàn)符合FMF，且攜帶該突變，因此認(rèn)為該突變的分類應(yīng)為DM。

MEFV編碼的蛋白是Pyrin，其能感知各種細(xì)菌毒素對(duì)宿主細(xì)胞Rho GTPases的修飾和失活，進(jìn)而形成一個(gè)新的炎癥小體復(fù)合物，并激活半胱天冬酶，在抗細(xì)菌天然免疫中發(fā)揮重要作用[23]。當(dāng)MEFV基因發(fā)生突變，Pyrin會(huì)在結(jié)構(gòu)或序列上發(fā)生改變，其正常生理功能發(fā)生變化，不能對(duì)外界信號(hào)進(jìn)行感應(yīng)或者對(duì)外界信號(hào)出現(xiàn)過(guò)度反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致相應(yīng)的疾病。FMF患者體內(nèi)的Pyrin就是對(duì)外界信號(hào)發(fā)生了過(guò)度或者錯(cuò)誤反應(yīng)，出現(xiàn)了自身免疫性疾病。秋水仙堿和其他多個(gè)微管蛋白藥物均能特異性抑制Pyrin炎癥小體，這些微管藥物并不能抑制細(xì)菌毒素誘導(dǎo)Pyrin去磷酸化及其與14-3-3蛋白的解離，而是通過(guò)阻斷Pyrin招募下游接頭蛋白發(fā)揮抑制性作用[24]。這為臨床用藥提供了理論依據(jù)。

歐洲風(fēng)濕病防治聯(lián)合會(huì)(EULAR)提出的FMF 管理指南建議，確診FMF后需盡早使用秋水仙堿治療[25]。起始劑量推薦5歲以下兒童的服用劑量為小于或等于0.5 mg/d，5～10歲兒童為0.5～1.0 mg/d，10歲以上兒童和成人為1.0～1.5 mg/d，如果藥片劑量為每片0.6 mg，上述劑量依次變?yōu)樾∮诨虻扔?.6、0.6～1.2、1.2～1.8 mg/d。如果患者在診斷前就已經(jīng)有并發(fā)癥出現(xiàn)(如淀粉樣變性等)或病情較重，應(yīng)加大起始劑量。本例患兒的癥狀較輕，且為本科首例因周期性發(fā)熱應(yīng)用秋水仙堿的患兒，因此起始劑量較小(0.5 mg/d，考慮體質(zhì)量后為0.01 mg·kg-1·d-1)。治療1個(gè)月后門診復(fù)診，患兒體溫好轉(zhuǎn)，但仍有發(fā)熱出現(xiàn)，紅細(xì)胞沉降率下降不明顯，且患兒無(wú)皮疹、肝腎功能異常等藥物不良反應(yīng)，因此加大劑量治療(1 mg/d，考慮體質(zhì)量后為0.02 mg·kg-1·d-1)，發(fā)熱不再出現(xiàn)，紅細(xì)胞沉降率逐漸將至正常。

EULAR的FMF 管理指南同時(shí)提出，應(yīng)每6個(gè)月對(duì)患者的治療效果，不良反應(yīng)和用藥依從性檢測(cè)1次。身體或情緒壓力較大時(shí)會(huì)觸發(fā)FMF的發(fā)作，此時(shí)相應(yīng)提高秋水仙堿的劑量。如果FMF患者伴有慢性關(guān)節(jié)炎，應(yīng)輔以其他藥物進(jìn)行治療，如白細(xì)胞介素-1拮抗劑等生物制劑、關(guān)節(jié)內(nèi)類固醇注射和抗風(fēng)濕病藥物。秋水仙堿的不良反應(yīng)主要是對(duì)肝腎損傷，應(yīng)引起足夠的重視并進(jìn)行預(yù)防。定期檢查肝酶，如果肝酶升高到正常上限值的兩倍以上，應(yīng)減少秋水仙堿劑量并進(jìn)一步檢查原因。對(duì)腎功能不全者，秋水仙堿的不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)很高，應(yīng)定期檢查肌酸磷酸激酶水平，并相應(yīng)調(diào)整秋水仙堿劑量?；颊咴谑芫言屑安溉槠跁r(shí)，不用停止秋水仙堿治療。如果患者病情平穩(wěn)持續(xù)5年以上，且急性期蛋白沒(méi)有升高，可以考慮降低秋水仙堿劑量，但是仍需定期檢查，及時(shí)干預(yù)[25]。

綜上所述，臨床醫(yī)生在見(jiàn)到反復(fù)性發(fā)熱的患者時(shí)，應(yīng)在排除感染和腫瘤等因素后，結(jié)合FMF的診斷標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)行基因檢測(cè)，以確診該病。本研究通過(guò)基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FMF患兒MEFV基因發(fā)生c.442G>C(p.E148Q)和c.1588-69G>A復(fù)合雜合變異，該內(nèi)含子變異在之前并未在非阿拉伯人群中報(bào)道過(guò)。確診后，需盡早使用秋水仙堿治療，并及時(shí)隨訪患者情況，調(diào)整秋水仙堿用量。