李佳赟，馬 進，王依純，朱紹華

(浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 臨安 311300)

日益加劇的土壤鹽堿化已成為影響農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要危害因子，預計到2050年，全球將會有1/2的耕地鹽堿化[1-2]。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)根系發(fā)達且具有根瘤菌，固氮能力強，能夠快速使海涂覆綠，加快海涂生物治理脫鹽，提高土壤肥力，改善海涂生態(tài)環(huán)境，可作為一種新的圍墾海涂的改良先鋒綠化植物，開發(fā)出更多的土地后備資源，實現耕地占補平衡。從國外引進的高秋眠級紫花苜蓿品種表現出產量高、品質好和再生快等特點，但其耐鹽能力有限，無法在南方沿海灘涂鹽堿地大規(guī)模種植。利用現代生物學技術，創(chuàng)制南方型紫花苜蓿耐鹽新種質，是培育耐鹽堿海涂種植紫花苜蓿新品種的根本途徑，而明確南方型紫花苜蓿鹽脅迫應答的調控機制是首要前提。

近年來，植物耐鹽有關方面的研究越來越受到重視。據報道，植物在應對鹽脅迫時，葉片中的脯氨酸含量明顯上升[3-6]。鹽處理下，光葉漆(RhusglabraL.)等樹種的樹高、生長量和生物量積累均有不同程度的下降，且鹽濃度越高，降幅越大[7]。另外，由于植物耐鹽性屬于復雜的數量遺傳性狀，單純從基因或蛋白質水平上研究具有片面性，因為基因與蛋白質水平上的變化并不一致，而蛋白質合成后的各種修飾往往會帶來細胞活性的改變[8-9]。植物在響應和適應鹽脅迫的過程中，需要不斷調節(jié)自身復雜的代謝網絡來維持系統(tǒng)內部的動態(tài)平衡。為明確紫花苜蓿響應鹽脅迫的代謝途徑，以南方型紫花苜蓿野生型和耐鹽突變體為材料，測定鹽脅迫下野生型與突變體紫花苜蓿的根長、株高、生物量積累以及葉片的代謝產物，繪制紫花苜蓿葉片的代謝通道，分析鹽脅迫下野生型與突變體紫花苜蓿葉片的代謝產物差異，從代謝組水平上明確紫花苜蓿葉片對鹽脅迫的響應機制。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

以南方型紫花苜蓿品種Millennium野生型(Wild type,WT)為材料，通過以NaCl為選擇因子對長期繼代培養(yǎng)的紫花苜蓿愈傷組織進行選擇，篩選出耐1.2% NaCl的耐鹽細胞系，經生理檢測為體細胞無性系突變體(Mutant,MT)紫花苜蓿[10]，經過3代自交，進行抗鹽性鑒定篩選，發(fā)現該突變體耐鹽性可以穩(wěn)定遺傳，以該突變體的T4代為材料進行研究。

將紫花苜蓿突變體和野生型種子置于培養(yǎng)皿中，于20 ℃生長箱內發(fā)芽。5 d后，將種子發(fā)芽后的小苗轉移至裝滿細沙和珍珠巖(體積比3∶1)的塑料盆中。用1/2Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)4周后，各取野生型和突變體12盆進行試驗。以添加250 mmol/L NaCl的1/2Hoagland 營養(yǎng)液進行培養(yǎng)作為鹽脅迫處理(NS)，以1/2Hoagland營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)作為對照(CK)。處理72 h后，從每個處理每個材料中隨機取3盆測定生長指標；另取每個處理每個材料剩余的3盆，分別采收紫花苜蓿葉片，混合后于液氮中冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?，用于代謝產物的提取。

1.2 生長指標測定

分別對野生型和突變體紫花苜蓿的株高(cm)進行測量，然后將植株的地上部和地下部分開，用蒸餾水多次沖洗根系直至干凈，并將根系水分吸干，測量植株的根長(cm)。最后，將植株的地上部和地下部放入烘箱120 ℃殺青30 min，然后80 ℃烘干至恒質量，測量地上部和地下部的干質量(g)。

1.3 代謝產物提取和鑒定

分別取CK和鹽處理葉片組織樣品(50 mg)轉移至1.5 mL EP管(Eppendorf Micro Test Tubes，Eppendorf China Limited，Shanghai City，China)，先加入0.5 mL提取液(V甲醇∶V氯仿= 3∶1)，再加入60 μL核糖醇(0.2 mg/mL保存于dH2O)作為內標，漩渦混勻，然后使用熱混合儀于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取出0.4 mL上清液轉移到2 mL GC-MS玻璃小瓶中作為新樣品。將80 μL甲氧基胺化試劑(20 mg/mL吡啶溶液)加入到新樣品中，渦旋10 s，在真空濃縮器中干燥，并置于37 ℃烘箱2 h。之 后，向每個樣品中加入0.1 mL BSTFA試劑(含1%TMCS，V/V)，70 ℃振蕩1 h。當所有樣品的溫度降至室溫時，通過氣相色譜和飛行時間質譜聯用進行GC-MS分析。最后，將歸一化的數據導入Simca-P軟件，釆用PLS-DA(Partial least squares-discriminant analysis)模型第一主成分的VIP值(>1)并結合Student’st-test檢驗的P值(閾值0.05)尋找差異表達代謝產物，用MST商業(yè)數據庫鑒定各種代謝產物。

1.4 數據分析和代謝網絡的構建

采用多元變量統(tǒng)計分析方法(PCA、PLS-DA、OPLS-DA)對代謝產物進行分析，不同處理代謝產物的差異用t檢驗和ANOVA進行分析。利用Metaboanalyst進行代謝途徑檢索，選擇擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、百脈根(Lotuscorniculatus)和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)等相關代謝數據庫進行比對，并參考KEGG代謝數據庫繪制代謝通路。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下野生型和突變體紫花苜蓿的生長變化

表1表明，與CK相比，鹽脅迫下突變體和野生型紫花苜蓿株高、根長、地上和地下部干質量均下降，其中,野生型紫花苜蓿地上和地下部干質量降幅最大。同時，鹽脅迫下突變體紫花苜蓿地上和地下部干質量、株高、根長的降幅小于野生型。

表1 鹽脅迫對野生型和突變體紫花苜蓿生長的影響

2.2 鹽脅迫下野生型和突變體紫花苜蓿葉片代謝圖譜的主成分分析(PCA)

利用SIMCA-P軟件，將鹽脅迫72 h處理組和CK組紫花苜蓿葉片的代謝產物數據進行對數轉換處理，然后進行自動建模，同時利用正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)的統(tǒng)計方法對結果進行PCA分析(圖1)，以反映野生型和突變體紫花苜蓿葉片代謝圖譜中的相似性和差異性。

WS、MS分別表示鹽處理下野生型、突變體紫花苜蓿葉片，WC、MC分別表示對照處理下野生型、突變體紫花苜蓿葉片

由圖1可知，鹽脅迫下野生型與突變體紫花苜蓿葉片在PC1上有明顯分離，PC1的貢獻率為38.4%，而PC2貢獻率則為25.5%，表明野生型與突變體紫花苜蓿葉片的代謝調控不同。因此，對代謝產物進一步分析，構建出代謝通路，可揭示紫花苜蓿葉片的耐鹽調控機制。

2.3 鹽脅迫下野生型和突變體紫花苜蓿葉片差異代謝產物分析

基于氣相色譜-飛行時間質譜(GC-TOF/MS)代謝組數據的固有特性，使用多元變量統(tǒng)計分析方法對數據進行分析，通過比較野生型和突變體紫花苜蓿葉片在鹽脅迫下的差異代謝產物，探討紫花苜蓿葉片在鹽脅迫下代謝途徑的變化。通過數學統(tǒng)計分析及篩選(P<0.05，VIP>1)，從極性提取物中篩選出差異代謝產物，野生型和突變體紫花苜蓿葉片中共篩選出41種重疊的差異代謝產物。由表2可見，41種共同差異代謝產物中，鹽脅迫處理下突變體葉片中有25種上調，16種下調，尤其是氨基酸類代謝產物，上調的有11種；而鹽脅迫處理下野生型葉片中有18種上調，23種下調，其上調的代謝產物主要是有機酸。與CK相比，鹽脅迫下野生型葉片中脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸含量增加，而甘氨酸、絲氨酸、谷氨酸、賴氨酸、亮氨酸、β-丙氨酸含量降低；突變體葉片中除賴氨酸含量較CK降低外，其他氨基酸的含量均增加。與CK相比，鹽脅迫下野生型葉片中蘋果酸含量顯著下降，而檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富馬酸、異檸檬酸、馬來酸含量顯著增加；鹽脅迫下突變體葉片中富馬酸和異檸檬酸含量較CK極顯著增加外，其他有機酸含量均下降。與CK相比，鹽脅迫下野生型葉片中月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻酸和肉豆蔻酸含量均明顯下降，突變體葉片中月桂酸和硬脂酸含量增加，其他脂肪酸含量均下降。與CK相比，鹽脅迫下野生型葉片中半乳糖、果糖-6-磷酸和磷酸烯醇含量增加，而甘露糖、木糖、海藻糖、肌醇、Myo-肌醇、麥芽糖、6-磷酸葡萄糖和葡萄糖含量下降；鹽脅迫下突變體葉片中甘露糖、半乳糖、肌醇、Myo-肌醇和果糖-6-磷酸含量顯著或極顯著增加，而木糖、海藻糖、麥芽糖、6-磷酸葡萄糖、葡萄糖和磷酸烯醇含量降低。

表2 鹽脅迫下野生型與突變體紫花苜蓿葉片代謝產物的變化Tab.2 Metabolic profile changes in leaves of wild-type and mutant alfalfa after salt stress μmol/g

注：*、**分別表示鹽處理和CK差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

Note:* and ** indicate that the difference between the salt treatment and the control was significant(P<0.05) and extremely significant(P<0.01).

2.4 鹽脅迫下野生型和突變體紫花苜蓿葉片代謝產物的代謝通路分析

對所得代謝產物與KEGG數據庫進行比對發(fā)現，野生型與突變體紫花苜蓿葉片代謝產物主要集中在氨基酸生物合成、氨酰-tRNA生物合成、三羧酸(TCA)循環(huán)、半乳糖代謝過程中(圖2)。有11個氨基酸、7個糖、2個糖醇和5個有機酸參與了糖酵解、氨基酸合成和TCA循環(huán)。通過對代謝產物和代謝通路進行整合分析，發(fā)現鹽脅迫下野生型紫花苜蓿葉片中參與TCA循環(huán)的檸檬酸、富馬酸、α-酮戊二酸、馬來酸、琥珀酸含量與CK相比顯著上調，甘露糖、葡萄糖、木糖、海藻糖、麥芽糖顯著下調；鹽脅迫下突變體紫花苜蓿葉片中絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、β-丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、谷氨酸、脯氨酸和Myo-肌醇含量顯著上調。

A表示野生型紫花苜蓿葉片鹽處理/CK；B表示突變體紫花苜蓿葉片鹽處理/CK；黑色和灰色框分別表示代謝產物顯著上調和下調(VIP>1，P<0.05)；白色框表示代謝產物無顯著變化

3 結論與討論

鹽脅迫下植物會受到不同程度的傷害，其生物量變化反映鹽脅迫對植物的影響，同時也是衡量植物耐鹽性的直接指標。研究表明，隨著土壤鹽度升高，高粱(Sorghumbicolor)等植物生長受到抑制[11-16]。本研究結果顯示，與CK相比，鹽脅迫后野生型和突變體紫花苜蓿的株高、根長、地上和地下部干質量降低，這說明鹽脅迫對野生型和突變體紫花苜蓿的生長均有抑制作用，但鹽脅迫下，野生型紫花苜蓿的株高、根長及地上地下干質量等生長參數的降幅大于突變體，說明突變體對鹽脅迫具有較好的適應性，表現出較強的耐鹽性。

植物在受到鹽脅迫時，為了調節(jié)細胞質與環(huán)境之間的滲透壓，體內會積累一些小分子物質來降低水勢，這些小分子物質被稱為滲透調節(jié)物質[17]，主要包括有機酸、氨基酸、脂肪酸、糖及多元醇等代謝產物[18]。研究表明，鹽脅迫下，植物體內的葡萄糖、果糖、蔗糖等可溶性糖含量升高[19-20]，這可能是因為植物通過調節(jié)細胞內的滲透勢來保護細胞結構完整，從而更好地應對鹽脅迫帶來的傷害[21]。此外，多元醇、甲基衍生物松醇和肌醇也被公認為是滲透調節(jié)物，并且在脅迫條件下顯著積累，在植物響應逆境脅迫時發(fā)揮一定的作用[22-25]。本研究結果顯示，與CK相比，鹽脅迫下野生型紫花苜蓿葉片中半乳糖和果糖-6-磷酸含量上升，其他可溶性糖和肌醇含量均有所下降。野生型紫花苜蓿并不是通過增加可溶性糖和肌醇類滲透調節(jié)物質來適應鹽脅迫。與CK相比，鹽脅迫下突變體紫花苜蓿葉片則積累更多的肌醇、甘露糖、半乳糖等滲透調節(jié)物質。氨基酸既能合成蛋白質，又是植物應對環(huán)境脅迫時產生相關代謝產物的前體[26]。研究證實，鹽脅迫下，脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酸等氨基酸含量增加可減輕荷花(Nelumbonucifera)受到鹽脅迫的傷害[27]。本研究發(fā)現，與CK相比，鹽脅迫下野生型和突變體紫花苜蓿葉片中脯氨酸和蘇氨酸含量顯著上升，但突變體紫花苜蓿葉片中積累的氨基酸總量比野生型積累得更多?？梢?，突變體紫花苜蓿葉片可通過積累更多的氨基酸、肌醇、甘露糖、半乳糖等滲透調節(jié)物質來增強對鹽脅迫的適應性。

在應對逆境脅迫時，參與植物體內物質和能量代謝的有機酸含量會發(fā)生變化，植物在正常生長環(huán)境中，體內有機酸含量很低，而在響應鹽脅迫逆境時有機酸含量則會升高，但不會對植物細胞造成傷害[28]。本研究發(fā)現，與CK相比，鹽脅迫下野生型紫花苜蓿葉片中參與TCA循環(huán)的檸檬酸、富馬酸、α-酮戊二酸和琥珀酸含量顯著上調，表明TCA循環(huán)增強。而葡萄糖、甘露糖、木糖等含量顯著下降，這表明野生型紫花苜蓿葉片中一些糖含量的降低，可能使碳水化合物的合成受到抑制，讓更多糖類流入TCA循環(huán)中，從而適應鹽脅迫。同時，與CK相比，鹽脅迫下突變體葉片中參與TCA循環(huán)的檸檬酸、α-酮戊二酸、馬來酸和琥珀酸含量減少。表明突變體紫花苜蓿響應鹽脅迫時與TCA循環(huán)并無明顯關系。

脂肪酸是植物細胞膜的重要組成成分，鹽脅迫下植物細胞結構受到破壞，細胞內容物大量溢出，造成脂肪酸含量降低[29]。研究表明，生物通過脂肪酸脫飽和維持膜的流動性來適應外界環(huán)境變化，而脂肪酸和質膜是植物應對鹽脅迫響應時的重要物質[30]。本研究發(fā)現，與CK相比，鹽脅迫下野生型紫花苜蓿葉片中脂肪酸含量不僅沒有增加反而出現下降的現象，而鹽脅迫下突變體葉片中除月桂酸、硬脂酸外，其他脂肪酸的含量都有不同程度下降，這說明脂肪酸含量的降低可能是紫花苜蓿響應鹽脅迫的一種適應性策略。

綜上，鹽脅迫對突變體紫花苜蓿生長的抑制作用明顯低于野生型紫花苜蓿，說明突變體紫花苜蓿比野生型紫花苜蓿具有更高的耐鹽性。鹽脅迫下，野生型紫花苜蓿葉片中的差異代謝產物有18種上調、23種下調，而突變體葉片中則有25種上調、16種下調。與CK相比，鹽脅迫下野生型紫花苜蓿葉片中葡萄糖、甘露糖、木糖等可溶性糖和脂肪酸含量下降，而突變體葉片中脯氨酸、谷氨酸、肌醇和甘露糖等有機化合物含量上升，說明野生型與突變體紫花苜蓿葉片的耐鹽機制明顯不同。野生型紫花苜?？赡苁峭ㄟ^加強TCA循環(huán)釋放出更多的ATP來應對鹽脅迫，而突變體紫花苜蓿則通過減少ATP的消耗，積累較多的滲透物質(脯氨酸、糖、肌醇)來增強其耐鹽性。